ля (рис, 24,в). Разворачиванию белковой глобулы можно также воспрепятствовать, если поместить молекулу фермента в ячейку носителя, не взаимодействующую с ней ни химически, ни сорб-ционно, но столь «тесную», чтобы развернутая конформация не могла образоваться по стерическим причинам. В этом случае натиннаэт кпнформапия белка могли бы поддерживаться чисто механическим путем.
Стабилизацию фермента в «тесных» ячейках методически проще всего осуществить включением белков в полимерные гели, например при проведении процесса полимеризации мономеров в присутствии фермента. Известно (см. гл. 1), что попе-речно сшитые полимерные гели (полиакриламидный, полисаха-рндные и др.) имеют пористую структуру. В геле, как правило, наблюдается относительно узкое распределение пор по размерам; размер пор задается концентрацией полимерных цепей. Он тем меньше, чем выше концентрация полимера в геле. Поэтому, включая фермент в гели различной концентрации, можно реализовать ситуацию, когда белковая глобула окажется «зажатой» полимерными цепями носителя и благодаря этому «клеточному эффекту» не сможет развернуться, В таких случаях достигаются существенные стабилизационные эффекты: включенные в гель ферменты в тысячи раз стабильнее своих на тивных (неиммобилизованных) предшественников, причем стабилизация проявляется тем сильнее, чем выше концентрация полимера.
|
|
Практическое применение гелевых препаратов тормозится, однако, тем, что в водных растворах гидрофильные гели сильно набухают. При этом значительно уменьшается концентрация полимера в гелевой фазе и, следовательно, нарушается соответствие размеров пор геля и белковой глобулы. Один из способов устранения этого нежелательного эффекта заключается в том, что при получении гелей увеличивают концентрацию сшивающего агента; за счет этого макроструктура образовавшихся гелей получается более жесткой и они набухают в гораздо меньшей степени.
§ 5. Пучи стабилизации ферментов,
не основанные на методе иммобилизации
Стабильные препараты иммобилизованных ферментов можно получать не только методами иммобилизации, но и другими путями. Иммобилизации подвергают ферменты, которые сами по себе обладают высокой стабильностью. Это прежде всего высокостабильные биокатализа торы t встречающиеся в природе. Для этого проводят поиск ферментов, обладающих высокой термостабильностью, как в мезофильных организмах, живущих при обычных температурах, так и в термофильных микроорганизмах, которые самой природой приспособлены для существо-вания & высокотемпературном режиме. Кроме того, стабильные
|
|
ш
ферментные препараты можно создавать искусственным путем, например методами химической модификации и белковой инженерии.
Химическая модификация белков. Со времени появления пер-вых сообщений об изменении стабильности ферментон в резуль тате модификации их функциональных групп химическими реагентами (середина 50-х годов) предпринимались неоднократные попытки стабилизировать ферменты методом химической модификации. Анализируя эти попытки, удается выделить следующие основные молекулярные причины повышения стабильности белков при их ковалентнон модификации:
1) в результате химической модификации белок может перей
ти в отличную от нативной, например, более стабильную кон-
формацию;
2) при химической модификации в белок зачастую вводятся
новые функциональные группы, способные завязать дополни
тельные стабилизирующие белок водородные связи или солевые
мостики;
3) химическая модификация неполярными соединениями
иногда усиливает в белках гидрофобные взаимодействия;
4) в результате модификации гидрофильными соединениями
поверхностных гидрофобных областей в белке уменьшается пло
щадь неблагоприятного контакта внешних неполярных остат
ков с водой, что должно стйбилизонать белок.
Белковая инженерия. В начале 80-х годов в генетической инженерии был разработан метод, позволяющий получать измененные белки, отличающиеся от белков-прототипов заменой всего лишь одного аминокислотного остатка в строго заданном положении. Для биотехнологии этот метод» названный сайт-специфическим мутагенезом, или белковой инжеЕ*ерией^ интересен тем, что позволяет целе^ап^ГаНйеннсГ измшштЬ~структуру ферментов, а значит, их каталитические свойства и стабильность.
Рассмотрим вкратце суть метода. Для белка с установленной первичной и третичной структурой {известно более сотни таких белков) выбирают так называемый сайт (или центр) мутации, т. е. тот аминокислотный остаток, который подлежит замене. Поскольку in vivo мутация всегда осуществляется при биосинтезе путем замены отдельных нуклеотидов в гене, то необходимо перейти с языка структуры белка (аминокислотной последовательности) на язык генетического кода. Для этого, во-первых, ищут (или создают искусственным путем) кольцевую генетическую структуру — плазм иду, в состав которой входит
нужный белок. Во-вторых, химическим путем
^ длиной 12—18 основа-
ний. Его химический состав должен быть таков, чтобы соответствовать небольшому участку первичной структуры выбран-ного* белка (длиной 4—6 аминокислотных остатков), включающего сайт мутации. Однако в процессе химического синтеза
вместо нуклеотидного т^ипдехдд кодирующего ^нативную аминокислоту»» в состав нуклеотидной последовательности вводят другой тр иплет, который кодирует новый аминокислотный ос-"таток! ШГ"~бснове однонитевой плазм иды и синтезированного олигонуклеотида ферментативным путем создают гетеродуп-лексную двуннтевую плазм иду, в состав которой входит «му-тантный ген», несущий информацию о структуре белка с заменой аминокислотного остатка в определенном положении. Далее путем генетико-инженерных манипуляций и клонирования гена получают клетки-трансформаторы» которые осуществляют биосинтез мутантного запрограммированного исследователем белка.
Использование метода белковой инженерии уже дало первые успехи в стабилизации ферментов. Оценивая перспективы метода, следует помнить, что он является и в течение некоторого времени будет оставаться довольно дорогостоящим- Поэтому наиболее эффективным будет его использование в случае тех ферментов» которые, во-первых, сами достаточно дорого стоят, и, во-вторых, инактивация которых связана с химической модификацией какой-то «ключевой» группы, существенной для инактивации белка (например, окислением SH-группы вблизи активного центра или дезамидированием остатков аспара-гина).
|
|
Глава
РЕГ0НЕРАЦ/1Я
КОМПОНЕНТОВ СИСТЕМ С ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ ФЕРШНТАМИ
Системы с иммобилизованными ферментами имеют относительно высокую стоимость, поэтому крайне желательно добиться многократного их использования. Иными словами, возникает проблема регенерации систем с иммобилизованными ферментами или, по крайней мере, их отдельных, наиболее дорогостоящих компонентов- К основным компонентам таких систем относятся носители, ферменты и кофакторы. Как правило, не возникает необходимости регенерировать носитель, так как используемые в промышленности носители либо дешевы, либо стабильны. В то же время достаточно остро стоит вопрос регенерации ферментов и кофакторов.