Теоретичні положення

Стерилізація є одним із найважливіших і необхідних прийомів у мікробіологічній практиці. Культивування організмів проводиться обов'язково в стерильних умовах. Під стерилізацією, чи знеплідненням розуміють повне знищення живих мікроорганізмів та їх спочиваючих форм (спор) у живильних середовищах, посуді, сухих матеріалах, на інструментах і інших предметах лабораторного устаткування.

Існують різні методи стерилізації: фізичний, механічний і хімічний.

Фізичні методи стерилізації:

· прожарювання в полум'ї;

· стерилізація сухим жаром (гарячим повітрям у сушильній шафі);

· стерилізація кип'ятінням;

· стерилізація насиченою парою під тиском (автоклавування);

· дробова стерилізація (тиндалізація).

· стерилізація ультрафіолетовим опроміненням.

Хімічні методи стерилізації:

· дезінфекція антисептиками;

Механічний метод стерилізації:

· фільтрування за допомогою мембранних фільтрів і фільтрів Зейтця.

Можливість та доцільність застосування того чи іншого способу визначається особливостями матеріалу, що підлягає стерилізації, його фізичними й хімічними властивостями, метою дослідження. Найчастіше в мікробіологічній практиці застосовується термічна стерилізація.

Стерилізація випалюванням у полум'ї пальника

Невеликі скляні й металеві предмети (голка, петля, пінцет, скальпель, палички, шпатель) стерилізують прожарюванням у полум'ї безпосередньо перед використанням. Стерилізація досягається обвуглюванням мікроорганізмів, що знаходяться на їхніх поверхнях. Випалюванням у полум'ї користуються для стерилізації поверхні ватяних пробок, горла посуду.

Стерилізація в автоклаві парою під тиском

Найбільш надійний і універсальний метод стерилізації живильних середовищ і матеріалів – стерилізація насиченою парою під тиском вище атмосферного. Підвищений тиск пари створюється у спеціальних герметично закритих товстостінних апаратах (автоклавах). Предмети, що підлягають стерилізації в автоклаві, загортають у папір. Повна стерилізація живильних середовищ забезпечується нагріванням протягом 20 хвилин за умови 120°С і надлишкового тиску 1 атм.

Стерилізація кип'ятінням

Стерилізацію металевих інструментів і гумових трубок проводять кип'ятінням. Спори деяких бактерій зберігають життєздатність під час кип'ятіння у дистильованій воді протягом декількох годин, тому рекомендується стерилізацію кип'ятінням проводити у 2 %-ном розчині карбонату натрію протягом 10 хв. У цих умовах спори гинуть.

Стерилізація сухим жаром

Сухим жаром стерилізують в основному скляний посуд. Щоб уникнути зараження предметів, що простерилізовані, із повітря, їх перед стерилізацією загортають в обгортковий папір і виймають із неї тільки перед роботою.

Стерилізація текучою парою. Дробова стерилізація, або тиндалізація

Живильні середовища (молоко, солод, желатин), воду, гумові трубки й інші предмети, що псуються від дії сухого жару, піддають стерилізації текучою парою. Стерилізацію текучою парою роблять у кип'ятильнику Коха чи в автоклаві з відкритим вентилем. Воду в них доводять до кипіння, і пара, що утвориться, обтікає об'єкти. Температура живильних середовищ, що стерилізуються, досягає 100°С. Нагрівання протягом 30–45 хвилин приводить до загибелі вегетативних клітин бактерій, але спори їх не гинуть. Наступного дня нагрівання повторюють. За цих умов гинуть вегетативні клітини, що розвилися зі спор. Для забезпечення повної стерильності рідину залишають ще на добу і знову повторюють нагрівання. Таку стерилізацію називають дрібною, або тиндалізацією.

Пастеризація

В основі пастеризації лежить нагрівання рідин до температури менше 100°С. Мета її – знищення безспорових бактерій у рідинах, що втрачають живильні властивості під час кип'ятіння (молоко, пиво, вино й ін.). Здійснюється пастеризація нагріванням рідин при 60°С упродовж 30 хвилин, чи при 75°С упродовж 15 хвилин, або при 80°С упродовж 10 хв.

Холодна стерилізація

Органічні рідини, що не виносять нагрівання, звільняють від бактерій, пропускаючи через стерильні дрібнопористі фільтри. Ці фільтри затримують мікроорганізми, їх називають бактеріальними фільтрами. Бактеріальні фільтри мають різні номери. Фільтри №1 мають середній діаметр пір 0,3 мкм, вони найбільш надійні. Перед уживанням мембранні фільтри стерилізують кип'ятінням. Фільтри поміщають у теплу дистильовану воду і кип'ятять 30 хвилин, змінюючи її 2–3 рази.

Предмети, що виготовлено з термолабільних пластмас, наприклад, центрифужні пробірки, стерилізують ультрафіолетовими променями. Час опромінення встановлюють експериментально. Воно залежить від потужності бактерицидної лампи й відстані між лампою й об'єктом.

У мікробіологічній практиці для вирощування мікроорганізмів використовують різноманітні живильні середовища, які за складом поділяють на природні, або натуральні, напівсинтетичні й синтетичні середовища.

Натуральні середовища складаються з продуктів рослинного й тваринного походження – м'яса, молока, картоплі, моркви, овочевих і фруктових соків, молочнокислої сироватки, відварів, екстрактів, отриманих із природних субстратів.

Прикладами натуральних середовищ можуть служити:

- м’ясопептонний бульйон, що складається з екстракту м'яса (500 мг м'яса на 1 л води), 0,5 % NaCl і 1 % пептону (продуктів неповного розкладання білка);

- несхмелене пивне сусло, яке приготовлене на основі солоду (пророслих зерен ячменя) і містить цукри;

- дріжджове середовище, що складається з екстракту дріжджів (7–10 г сухих дріжджів на 1 л води), до якого додають вуглеводи (1–2 %), мінеральні солі К₂НРО₄ (0,1 %); і NaCl (0,5 %);

- картопляне середовище – відвар картоплі (200 г картоплі на 1 л води);

- витяжки з ґрунту й ін.

На натуральних середовищах добре розвиваються багато мікроорганізмів, тому що в таких середовищах маються, як правило, усі компоненти, необхідні для їхнього росту.

Для вирощування мікроорганізмів, що використовують органічні форми азоту, найчастіше вживають м’ясопептонні середовища: м’ясопептонний бульйон (МПБ), м’ясопептонний агар (МПА) і м’ясопептонний желатин (МПЖ).

Іноді для культивування мікроорганізмів використовують напівсинтетичні середовища:

МПБ із 2 %-ним розчином глюкози; дріжджовий автолізат із солями амонію й вуглеводами у визначеному співвідношенні. Ці середовища широко використовують для одержання вітамінів, антибіотиків, амінокислот і інших продуктів.

Синтетичні середовища, що включають тільки відомі хімічно чисті речовини, у точно зазначених концентраціях: середовище Виноградського для нітрофікуючих бактерій, глюкозомінеральне середовище для Achromobacter.

Синтетичні середовища бувають простими за складом чи мають великий набір щодо компонентів. Їх широко використовують для вивчення обміну речовин мікроорганізмів.

За призначенням розрізняють елективні й диференційно-діагностичні середовища.

Елективні (виборчі) середовища забезпечують переважний розвиток одного виду чи групи родинних мікроорганізмів: середовище Чапека (для актиноміцетів), середовище Врублевського, Кітта-Тароцци (для анаеробів), МПА з новобіоцином (для сапрофітних стафілокків, стійких до новобіоцину).

Диференційно-діагностичні (індикаторні) середовища, що досить добре дозволяють відрізнити одні види мікроорганізмів від інших: середовище Ендо (для кишкових бактерій), вуглеводні середовища, до складу яких входять різні вуглеводи з індикатором.

За фізичним станом (консистенцією) поживні середовища розділяються на: рідкі (МПБ), густі (МПА), сипучі (розварене пшоно, висівки, що просочені живильним розчином).

Для з'ясування фізико-біологічних особливостей мікроорганізмів, а також для накопичення їхньої біомаси чи продуктів обміну найзручніше застосовувати рідкі середовища.

Напіврідкі середовища готують, додаючи 0,1–0,2 % агар-агару. Агар-агар – рослинний колоїд, що одержують із деяких морських водоростей (складається в основному з полісахаридів, включає азотисті речовини).

Сипучі середовища іноді застосовують у промисловій мікробіології. До них відносяться, наприклад, розварене пшоно, висівки, кварцовий пісок, просочені живильними розчинами.

Густі (тверді) середовища використовують для виділення чистих культур (одержання ізольованих колоній), у діагностичних цілях: опис колоній, встановлення характеру росту на скошеному МПА й ін., для збереження культур, для кількісного обліку мікроорганізмів, визначення їхніх антагоністичних властивостей. Густі середовища готують із рідких, додаючи для згущення агар-агар (1,5–2,5 %), желатину (10–15 %) чи кремнекислий гель. Найчастіше в мікробіологічній практиці для згущення середовищ використовується агар-агар. Це складний полісахарид, більшість мікроорганізмів не використовують його як живильний субстрат. У воді агар-агар утворює гелі, що плавляться при температурі 100°С, що твердіє при температурі близько 40°С. Желатин – білок, що одержують в процесі виварювання кісток і хрящів тварин. Желатин до рідких середовищ додають у кількості 10–15 % (желатиновий гель плавиться при 23–26°С).

Порядок виконання роботи

1. Ознайомитися з режимами стерилізації живильних, середовищ посуду й інструментів (додаток 2).

Живильні середовища стерилізують, головним чином, автоклавуванням, що проводять у різних режимах. Коли вказують режим стерилізації в одиницях тиску, мають на увазі додатковий тиск.

Температура та тривалість автоклавування визначається насамперед складом живильного середовища. Субстрати, що містять речовини, які не витримують нагрівання до 120°С, стерилізують із тиском 0,5 атм. Молоко, дріжджовий автолізат, середовища із желатиною стерилізують з тиском 0,5 атм протягом 15 хв. Середовища, що містять цукри і вітаміни, наприклад, пивне сусло, соки, стерилізують із тиском 0,5 атм 20–30 хв. МПБ і МПА автоклавують із тиском 1 атм 20–30 хвилин, картопляне середовище і ґрунтову витяжку – тиском 1,5 атм 30 хв.

2. Виготовити ватно-марлеві пробки для пробірок і колб різної ємності.

Ватно-марлеві пробки охороняють посуд із середовищами від зараження мікрофлорою, що знаходиться в навколишньому повітрі. Кращою ватою для виготовлення пробок є гігроскопічна вата. Правильно виготовлена пробка повинна легко входити в пробірку (колбу) і щільно прилягати до її стінок, не порушуючи газообміну між умістом судини і зовнішнім середовищем. Після витягу із посуду форма пробки не повинна змінюватися.

Для виготовлення пробки плоский шматок вати скачують валиком. Щоб додати пробці міцність, її прокочують між долонями, або між долонями і чистим склом, що лежить на столі. Довжина пробки для звичайної пробірки повинна бути близько 4 см. Пробка повинна входити в пробірку на 1,5–2 см. Для збереження форми пробку виймають із горлечка, злегка обертаючи. Зручно обгорнути пробку чистою марлевою серветкою.

3. Підготувати до стерилізації мікробіологічні пробірки, піпетки, чашки Петрі, шпателі Дригальського.

Основним способом стерилізації скляного посуду є обробка гарячим повітрям у сушильних шафах. Посуд перед стерилізацією ретельно миють, сушать і загортають у папір для збереження стерильності після прогрівання.

Пробірки, колби попередньо закривають ватно-марлевими пробками. Пробірки поєднують по 15–20 штук і загортають у папір.

Кожну піпетку загортають окремо в довгі смужки паперу шириною 3–4 см. Попередньо в кінець піпетки, що беруть у рот, вкладають ватяний тампон. Обмотку починають із протилежного кінця. Капілярний кінець піпетки кладуть на смужку папера під кутом 45° і загортають за спіраллю. Загорнені піпетки для запобігання від забруднення й розривів загортають кілька штук разом.

Шпателі обгортають окремо, а потім, як і піпетки, поєднують.

Чашки Петрі загортають у папір у формі квадрата. Чашку Петрі поміщають на середину листа, загинають його з двох протилежних сторін догори, край двічі загинають швом. Два вільних кінці загинають униз. Таке обгортання чашок дає можливість легко розрізняти верх і низ. Дві-чотири чашки Петрі загортають разом.

Підготовлений таким способом посуд поміщають у сушильну шафу і прогрівають при температурі 160–170°С упродовж 2 годин. В таких умовах гинуть не тільки бактерії, але і їхні спори. Температуру в сушильній шафі вище 175°С допускати не слід, тому що це призведе до побуріння ватяних пробок, а паперова обгортка стає ламкою.

Простерилізований посуд зберігають у закритому, захищеному місці. Розгортають її безпосередньо перед використанням.

4. Простерилізувати прожарюванням у полум'ї бактеріологічні петлі, голки, гачки.

Узяти бактеріологічну петлю управу руку й у горизонтальному положенні внести її у нижню, найбільш холодну частину полум'я, а потім перенести в положення, близьке до вертикального, і нагріти до червоності у верхній частині полум'я пальника спочатку нижню, потім верхню частину дроту і пропалити петлеутримувач. Прожарювати в цілому 5–7 с.

5. Ознайомитися з рецептурами різних натуральних і синтетичних живильних середовищ.

6. Приготувати рідке живильне середовище.

1) Солодове (несхмелене пивне) сусло – гарне середовище для деяких молочнокислих і оцтовокислих бактерій, дріжджів, мікроскопічних грибів і інших представників гетеротрофних організмів. Основні компоненти сусла – вуглеводи й азотвмісні речовини.

Несхмелене пивне сусло, що отримують із пивоварного заводу, розбавляють водою до 6–7° за Баллінгом і використовують для культивування багатьох мікроорганізмів. Якщо готове сусло відсутнє, користуються солодовим середовищем, що готують у такий спосіб. Зернівки ячменя пророщують до накльовування, потім висушують їх при температурі 60–70°С і мелють на кавовому млині. Нагрівають 1 л води до 50°С і, перемішуючи, всипають у неї 250 г меленого солоду. Залишають у воді без нагрівання на 30 хвилин, потім воду нагрівають і підтримують температуру 55–58°С. Час від часу з рідини беруть проби на крохмаль (йодна проба). Коли йодна проба покаже повне оцукрювання крохмалю, сусло фільтрують і потім стерилізують тиском 0,5 атм протягом 30 хвилин (так само стерилізують готове сусло). Варто мати на увазі, що для культивування дріжджів використовують сусло, яке містить 6–8 % цукру, а для молочнокислих бактерій – 8–12 %, тому у суслі потрібно визначити вміст цукру. Сусло стерилізують температурою 115°С і тиском 0,5 атм упродовж 30 хв.

2) Картопляне середовище використовується для виділення й культивування спороутворюючих амілолітичних бактерій. Для його готування бульби картоплі ретельно промити, очистити від шкірки і дрібно нарізати. 200 г такої картоплі залити 1 л водопровідної води, прокип'ятити протягом 20–30 хв. Відвар профільтрувати через вату і розлити в судини і простерилізувати (1 годину тиском 1 атм чи 30 хвилин тиском 1,5 атм).

3) Пептонна вода придатна для багатьох організмів. Для її готування до дистильованої води потрібно додати 1 % пептону і 0,5 % кухонної солі. Установити рН 7,2, кип'ятити 30 хвилин, знову перевірити рН. Потім розчин профільтрувати через паперовий фільтр до повної прозорості і стерилізувати протягом 30 хвилин при 120°С.

7. Приготувати густе живильне середовище на основі сусла і пептонної води (додати агар-агар із розрахунку 2 %).

Сусло-агар (СА) є прекрасним середовищем для молочнокислих бактерій і дріжджів. Для одержання твердого сусла-агару до пивного сусла додають 2 % агару. Середовище стає однорідним безпосередньо в процесі стерилізації в автоклаві. Якщо необхідно приготовлене середовище відразу розлити у пробірки, його попередньо перед стерилізацією розплавляють на водяній бані.

Для фільтрування агарових середовищ застосовують ватно-марлевий фільтр. Для його готування скляну лійку треба покрити марлевою серветкою такої величини, щоб кінці серветки були перекинуті через край лійки назовні, потім на марлю покласти шар гігроскопічної вати і змочити фільтр гарячою дистильованою водою. Агаризоване середовище налити на фільтр у гарячому виді. Процес фільтрації вести в нагрітій водяній бані.

8. Підготувати середовища до стерилізації.

Після фільтрації живильні середовища розливають в судини (колби Ерленмейєра ємністю 250 мл). Наливати треба не вище 2/3 висоти судини. Посуд заздалегідь ретельно миють, висушують, закривають ватно-марлевими пробками, що охороняє середовище від зараження мікроорганізмами, які знаходяться в навколишньому повітрі. Тому пробки повинні бути досить щільними, з рівномірним розподілом волокон вати. Не можна обертати пробки судин, що будуть стерилізуватися в автоклаві, целофаном чи іншими матеріалами, що не пропускають пару. Пара повинна обов'язково проникати через пробку в судину, інакше середовища не нагріються до потрібної температури і не простерилізуються. Посуд необхідно заздалегідь простерилізувати, якщо налиті в нього середовища стерилізують текучою парою чи тиском не більш 0,5 атм. Якщо ж живильні середовища стерилізують під тиском вище 1 атм, то попередня стерилізація посуду необов'язкова.

Середовище з агаром нагрівають на киплячій водяній бані до повного його розплавлення. Якщо передбачається вирощування мікроорганізмів на скошеному агаризованому середовищі в пробірках, то кожну пробірку заповнюють середовищем не більш, ніж на 1/3. Для розливання живильних середовищ користуються лійкою. Потрібно стежити за тим, щоб край пробірок чи флаконів не був змочений живильним середовищем, тому що ватно-марлеві пробки можуть приклеїтись до скла під час стерилізації і будуть важко вийматися, ускладнюючи процес роботи.

Поверх ватно-марлевої пробки на колби й флакони варто надягти паперові ковпачки й підписати назву живильного середовища та дату її готування.

Щоб середовище не підсихало, його скошують після стерилізації, перед посівом. Для цього пробірки з розплавленим на киплячій водяній бані середовищем установлюють у похилому положенні і дають середовищу застигти. Скошена агаризоване середовище не повинно доходити до ватяної пробки на 4–6 см. Середовище, що призначено для культивування бактерій у чашках Петрі, розливають по 15–20 мл у пробірки більшого об’єму, ніж для скошеного агаризованого середовища чи стерилізують у колбах. В останньому випадку до стерилізації агар не розплавляють.