2015-10-16
505
Современный подход к исследованию механизма действия фермента включает примерно следующую последовательность событий
1. Выделение фермента до гомогенного состояния и определение последовательности аминокислот и пространственной структуры. Сравнение полученных основных структурных свойств фермента с аминокислотными последовательностями и пространственными структурами родственных белков, используя доступные компьютерные базы данных. Найденные последовательности аминокислот и данные о пространственной структуре уже имеющиеся в базах данных, касающиеся исследуемого фермента будут полезны для идентификации инвариантных остатков аминокислот выполняющих ведущую роль в структуре фермента и его функциональной активности.
2. Изучение кинетики и субстратной специфичности фермента, и идентификация ингибиторов.
3. Идентификация ключевых функциональных боковых цепей аминокислот, и проведение 'сайт-направленного мутагенеза', используя клонированный ген данного фермента, чтобы подтвердить важность этих ключевых остатков аминокислот:
|
|
|
- Являются ли они существенными для каталитической активности?
- Являются ли они важными для связывания субстрата?
- Являются ли они важными для стабильности пространственной структуры фермента?
4. Построение гипотезы из данных особенностей химической реакции и перестроек химических связей, происходящих во время катализа. Проверка этойгипотезы 'сайт-направленным мутагенезом' и методами идентификации промежуточных соединений, образующихся во время катализа.
5. Проверка полученных результатов в физиологических условиях. Изучение механизмов регуляции активности этого фермента, идентификация эффекторов, влияющих на активность и выяснение значения этих эффекторов в процессах жизнедеятельности клетки.
6. В медицинской биохимии на основании данных о роли фермента и механизме действия разработать методы исследования этого фермента в биологических жидкостях и исследовать влияние химических аналогов субстратов и регуляторов в качестве потенциальных лекарственных препаратов.
