Опыт 7. Осаждение белков алкалоидными реактивами

Осаждение белков алкалоидами относится к необратимым реакциям. Наиболее часто используются танин, пикриновая кислота и др. Механизм осаждения белков алкалоидными реактивами связан с образованием нерастворимых солеобразных соединений с основными азотистыми группами белка.

Порядок выполнения опыта. К 5 каплям раствора белка прибавляют 1-2 капли насыщенного раствора танина (представляет собой сложный эфир галловой кислоты и глюкозы) и 1-2 капли 1%-ного раствора уксусной кислоты. Выпадает осадок белка желтовато-серого цвета. Аналогичную реакцию можно провести с пикриновой кислотой.

Лабораторная работа 4. Определение изоэлектрической точки желатины

В 5 пробирок наливают 0,2 М раствора уксуснокислого натрия и 0,2 М раствора уксусной кислоты в количествах, указанных в таблице. В каждую пробирку к 1 мл заготовленной буферной смеси приливают по 0,5 мл 1%-ного раствора желатины, перемешивают и добавляют по 2 мл этилового спирта. Содержимое пробирок вновь перемешивают и оставляют на 5 мин. Через 5 мин отмечают, в какой пробирке и при каком рН произошло наибольшее помутнение раствора. Отсутствие мути отмечают знаком «минус», наличие и степень мутности ^_ одним или двумя знаками «плюс». Работу фиксируют в одной из таблиц в зависимости от применяемого буфера.

Таблица

Определение изоэлектрической точки желатины

(буфер уксуснокислый натрий – уксусная кислота)

Пробирка	Количество 0,2 М раствора СН₃СООNа, мл	Количество 0,2 М раствора СН₃СООН мл	рН смеси	Добавлено 1%-ного раствора желатины, мл	Добавлено раствора этанола, мл	Степень мутности
1	0,1	0,9	3,8	0,5	2
2	0,2	0,8	4,15	0,5	2
3	0,5	0,5	4,75	0,5	2
4	0,8	0,2	5,35	0,5	2
5	0,9	0,1	5,70	0,5	2

Выводы по работе должны быть связаны с наблюдением влияниея реагентов на осаждение белка и на изоэлектрическую точку.

Занятие 2. Продолжение темы «Простые белки».

Лабораторная работа 5. Биохимическое исследование мышечной ткани

Опыт 1. 20 г измельченной мышечной ткани (говяжий фарш готовится лаборантом) экстрагируют двойным объемом дистиллированной воды (40 мл) при встряхивании в течение 10 мин. Экстракт фильтруют через марлю, затем экстракцию повторяют. Водные экстракты объединяют, делят на две части, колбы подписывают.

Опыт 2. Остаток мышечной ткани экстрагируют при встряхивании тройным объемом 10%-ного раствора хлористого аммония (60 мл) или 5%-ного раствора сульфата магния 10 мин и отделяют солевой экстракт фильтрованием через марлю.

Опыт 3. В первой части водного экстракта, полученного в опыте 1, цветными реакциями обнаруживают наличие белка (в водный экстракт переходят белки: миоген, глобулин и миохром).

Опыт 4. Вторую часть водного экстракта, полученного в опыте 1, освобождают от белка кипячением в слабокислой среде (подкисляют уксусной кислотой). Осадок белка отфильтровывают. В фильтрате обнаруживают наличие фосфатов, хлоридов, сульфатов качественными реакциями. Молочную кислоту определяют следующим образом: в три пробирки наливают по 1 мл 1%-ного раствора фенола, добавляют по каплям раствор хлорного железа до появления фиолетовой окраски фенолята железа. В первую пробирку приливают 1 мл воды (эта пробирка служит контролем), во вторую ^_ приливают 1 мл стандартного раствора молочной кислоты (0,5%), в третью - полученный безбелковый мышечный экстракт. В пробирках, содержащих молочную кислоту, наблюдают замену фиолетовой окраски раствора на желтую.

Опыт 5. В солевом экстракте мышцы, полученном в опыте 2, цветными реакциями доказывают наличие белка (миозина и актомиозина). Устанавливают границы высаливания миозина. Для этого в 12 пробирок наливают по 2 мл солевого экстракта, затем приливают уменьшающиеся объемы воды (как это указано в таблице, стр. 2) и возрастающие объемы насыщенного раствора сульфата аммония (таблица, стр. 3). Пробирка с минимальной концентрацией сульфата аммония, дающая заметное осаждение белка, показывает нижнюю границу высаливания. Например, осадок начал образовываться с третьей пробирки, тогда нижняя граница высаливания будет на уровне 15% полного насыщения сульфатом аммония. После некоторого отстаивания выпавшие осадки отфильтровывают и к фильтратам добавляют по 3 мл насыщенного раствора сульфата аммония. Пробирка с минимальной концентрацией сульфата аммония, в которой при этом не образуется осадка и жидкость остается прозрачной, определяет верхнюю границу высаливания. Так, если первая из пробирок, в которой жидкость осталась прозрачной, № 11, то верхняя граница высаливания составляет 60% от полного насыщения сульфатом аммония.

№ пр-ки	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
Белок, мл	2,0	2,0	2,0	2,0	2,0	2,0	2,0	2,0	2,0	2,0	2,0	2,0
Вода, мл	7,5	7,0	6,5	6,0	5,5	5,0	4,5	4,0	3,5	3,0	2,0	1,0
Сульфат аммония, мл	0,5	1,0	1,5	2,0	2,5	3,0	3,5	4,0	4,5	5,0	6,0	7,0
% нсыщ	5,0	10	15	20	25	30	35	40	45	50	60	70

Выводы должны содержать результаты общих цветных реакций на белки, а также на хлориды, сульфаты, молочную кислоту, должно быть показано различие белков по образованию цветных реакций, найдены границы высаливания миозина.

При отчете по теме студент должен ответить на следующие вопросы:

1. Что такое белок?

2. Как связаны между собой аминокислоты в молекуле белка?

3. Напишите строение следующих полипептидов: а) глицил-аланил-валил-лейцил-изолейцин; б) трионил-аспарагил-лизил-тирозин; в) аргинил-триптофанил-лизил-пролин; г) серил-цистеил-аланин.

4. Какой преобладающий заряд несет молекула каждого из указанных веществ?

5. Какие цветные реакции возможны для этих веществ?

6. Какой реакции среды характеризуется изоэлектрическая точка каждого из полипептидов?

7. В чем заключается механизм цветных реакций на белки?

8. Каковы методы определения N- и С-концевых аминокислот?

9. Опишите гидролиз белка, назовитевиды гидролиза.

10. От чего зависит растворимость белка, какие факторы стабилизируют белок в растворе?

11. Рассмотрите уровни организации белковых молекул.

12. Укажите связи, формирующие каждую структуру.

13. Чем различаются структуры молекул глобулярных и фибриллярных белков?

14. Каковы общие механизмы осаждения белка из раствора?

15. Что такое высаливание белков?