Транскрипция в бактериальных клетках

Бактериальная хромосома содержит приблизительно 4000 генов, которые могут транскрибироваться как независимо друг от друга, так и координированно. Независимая транскрипция гена возможна, если он обладает собственным промотором и терминатором транскрипции. При координированной транскрипции группа генов имеет общий промотор и общий терминатор и составляет один непрерывный участок ДНК; мРНК, инициируемая на общем промоторе, содержит информацию для синтеза нескольких полипептидов. Группа генов, которые транскрибируются совместно, называется опероном.

РНК-полимеразы бактерий – олигомерные белки (α₂ββ^´σ) с молекулярной массой 500000. Первичная структура α,β,β¹ – субъединиц установлена Е.Д. Свердловым с сотрудниками. Полный фермент способен «узнавать» промотор и связываться с ним, образуя при этом прочный комплекс. Доказано, что при создании такого комплекса в промоторной последовательности (~40 п.о.) расплетается небольшой (10-15 п.о.) участок ДНК. Сразу же происходит инициация синтеза РНК, в результате которой образуется первая фосфородиэфирная связь. Первый нуклеотид на 5´-конце синтезируемой ДНК называется инициирующим. Чаще всего это пуриновый нуклеотид рр-рА либо р-р-р-G. Доказано, что новообразованная цепь РНК имеет трифосфатную группу на 5´-конце и свободную ОН группу на 3´-конце. После того как синтезируется сравнительно короткий олигорибонуклеотид, σ-субъединица отделяется от фермента, и дальнейшую полимеризацию (элонгацию) осуществляет комплекс α₂ββ^´, который называется минимальным ферментом (кор-ферментом). σ-Субъединицу можно рассматривать как фактор позитивной регуляции транскрипции; σ-субъединица участвует в выборе участка инициации. Установлено, что β´-субъединица участвует в связывании с ДНК-матрицей, а β-субъединица – в связывании субстратов – рибонуклеозидтрифосфатов.

Для терминации транскрипции на ДНК имеются особые сигналы – терминаторные последовательности. В этом случае терминация осуществляется минимальным ферментом, но иногда необходим дополнительный белковый фактор, называемый «ро» (ρ).

В матричной ДНК имеются стоп-сигналы, которые были расшифрованы. Все они имеют одну общую особенность: вслед за GC-богатой областью перед участком терминации располагается АТ-богатая последовательность. Кроме этого, терминирующие последовательности в молекуле ДНК обладают симметрией второго порядка GC-богатой области (полиндромы) (рис.7).

Следовательно, РНК-транскрипт этой области самокомплементарен, способен к образованию структуры шпильки. Кроме того, новообразованные цепи РНК кончаются несколькими остатками U, которые кодируются серией оснований А в АТ-богатой области ДНК-матрице. Одна или несколько подобных структурных особенностей заставляет РНК-полимеразу задержаться, сделать паузу, когда она сталкивается с таким сигналом (рис. 8).

В некоторых участках терминации новообразованные цепи РНК высвобождаются без участия дополнительных белков. В других местах для терминации цепи необходимо участие белка ρ «ро». Белок ρ-тетрамер с массой 200 кДа садится на РНК и движется по направлению к молекуле РНК-полимеразы, останавливая ее на участке терминации. Согласно этой модели белок ρ вытесняет РНК-полимеразу с 3´-конца РНК, что приводит к высвобождению РНК-транскрипта. При этом белок ρ гидролизует АТФ.

Идентификации нуклеотидных последовательностей ДНК, в которых РНК-полимераза начинает и заканчивает транскрипцию, посвящены многочисленные исследования. Однако пока не все ясно.

В эукариотических клетках содержится три РНК-полимеразы (I, II, III). РНК-полимерза I находится в ядрышке и участвует главным обоазом в биосинтезе р-РНК, в то время как РНК-полимеразы II и III обнаруживаются в хроматине и нуклеоплазме. РНК-полимераза II осуществляет синтез мРНК, а РНК-полимераза III отвечает за синтез тРНК и 5s-рРНК. Удлинение цепи РНК с помощью эукариотических ДНК-зависимых РНК-полимераз происходит таким же образом, как и при участии фермента из E.Coli, хотя эти ферменты отличаются друг от друга по субъединичной структуре и регуляторным элементам.

Транскрипты РНК, синтезированные при помощи РНК-полимеразы, обычно претерпевают дальнейшие ферментативные изменения, называемые посттранскрипционным процессингом, и только после этого они становятся функционально активными.

Так, рРНК и тРНК синтезируются в виде более длинных предшественников, которые затем модифицируются и расщепляются под действием нуклеаз с образованием конечных продуктов.

В некоторых случаях из одной длинной молекулы-предшественника в результате ферментативного расщепления образуется две и даже большее количество разных тРНК. В ходе посттранскрипционного процессинга в предшественниках т-РНК наряду с удалением концевых последовательностей происходят изменения двоякого типа. Во-первых, к некоторым тРНК присоединяется 3´-концевая тринуклеотидная последовательность – Ц-Ц-А(3´) (в других тРНК этот 3´-концевой фрагмент уже содержится в транскрипте). Во-вторых, ряд оснований в тРНК специфическим образом модифицируется: одни метилируются, другие дезаминируются, третьи восстанавливаются. Такие модифицированные основания располагаются во всех тРНК в определенных положениях мРНК. Эукариот тоже образуется в результате процессинга предшественников (у прокариот мРНК процессингу не подвергается).

Эукариотические мРНК, обнаруживаемые в цитоплазме, обладают тремя отличительными особенностями. Первая особенность состоит в том, что эукариотические мРНК - обычно моногенные молекулы, в то время как многие прокариотические мРНК – полигенные. Вторая особенность заключается в том, что эукариотические мРНК содержат на своем 3´-конце «хвост» из 100-200 последовательно присоединенных остатков аденозидов (А) – так называемый поли(А)-хвост. Этот «хвост» синтезируется отдельно из молекул АТФ с помощью полиаденилатполимеразы, которая работает в основном так же, как РНК-полимераза, и катализирует реакцию

nАТФ → (АМР)_n + nPP_i.

Полиаденилатполимеразе не нужна матрица, однако необходима затравка – мРНК.

Третья особенность большинства мРНК эукариот – это наличие в них 5´-концевого «кэпа» (шапки), представляющего собой остаток 7-метилгуанозина, присоединенного к 5´-концевому остатку мРНК посредством трифосфатной связи:

Функции «кэпа» и (А)-хвоста точно не известны. Возможно «кэп» связывается с рибосомой, инициируя процесс трансляции. Возможно это защита мРНК от разрушения ферментами.

В эукариотическом ядре мРНК должны пройти дальнейшие стадии процессинга, заключающиеся в удалении интронов (нетранслируемые участки в генах в отличие от экзонов – участков, кодирующих аминокислотную последовательность полипептида. Очень часто интроны в полинуклеотиде составляют 85% общей длины. Интроны часто оказываются гораздо длиннее экзонов).

Имеющиеся в настоящее время данные позволяют объяснить, как происходит удаление интронов.

Экзоны очень точно соединяются между собой с помощью молекул другого класса РНК, присутствующих в ядре и называемых малыми ядерными РНК (мяРНК). Функция этих коротких ядерных РНК, содержащих приблизительно сто нуклеотидов, состоит в удалении интронов. Нуклеотидная последовательность мяРНК комплементарна последовательностям на концах каждого из интронов. В результате спаривания оснований, содержащихся в мяРНК и на концах свернутого в петлю интрона, последовательности двух экзонов сближаются таким образом, что становится возможным удаление разделяющего их интрона и ферментативное соединение (сплайсинг) экзонов (рис. 9).

Важность этого процесса состоит в том, что ошибка всего лишь в один нуклеотид при сплайсинге может изменить рамку считывания в последовательности, расположенной после этой точки, и привести к синтезу на такой мРНК дефектной молекулы белка.

После завершения процессинга зрелая мРНК покидает ядро. Чтобы сделать это, мРНК сначала связывается с двумя специальными белками, которые проводят мРНК в цитоплазму сквозь поры в ядерной оболочке. Через поры могут проходить только созревшие мРНК. Обрывки РНК, оставшиеся после процессинга, расщепляются нуклеазами. Образовавшиеся нуклеозидмомофосфаты превращаются с помощью АТФ в нуклеозид 5´-трифосфаты и вновь используются для синтеза РНК в ядре.