Олигонуклеотид-направлепный мутагенез с использованием плазмидной ДНК

Основной недостаток одигонуклеотид-направленного мутагенеза с использованием фага М13 — большое число процедур. Чтобы выделить мутантную форму нужного гена, приходится затратить много времени. В качестве альтернативы системе с использованием фага M13 было разработано множество других подходов, основанных на применении плазмидных ДНК.

Один из этих подходов включает встраивание ДНК в плазмидный вектор, который несет функциональный ген устойчивости к тетрациклину и неактивный ген устойчивости к ампициллину; в середине последнего заменен один нуклеотид (рис. 8.3). Клетки E. coli трансформируют вектором, несущим ДНК-мишень, и двухцепочечную плазмидную ДНК денатурируют щелочью с тем, чтобы получить одноцепочечные кольцевые молекулы. Денатурированную ДНК отжигают с тремя разными олигонуклеотидами. Один из них предназначен для внесения изменений в клонированную ДНК-мишень, второй — для устранения мутации в гене устойчивости к ампициллину, третий — для замены одного нуклеотида в гене устойчивости к тетрациклину с тем, чтобы инактивировать этот ген. В реакционную смесь добавляют четыре дезоксирибонуклеозидтрифосфата и ДНК-полимеразу Т4, функционирующую аналогично фрагменту Кле-нова ДHК-полимеразы I Е. coli. Гибридизовавшиеся олигонуклеотиды служат затравками для синтеза ДНК, а интактная кольцевая молекула

Рис, 8.3. Олигонуклеотид-направленный мутагенез с использованием плазмидной ДНК. Ген-мишень встраивают в полилинкер вектора pALTER. Плазмидную ДНК денатурируют в щелочи и отжигают с тремя олигонуклеотидами: «мутагенным» олигонуклеотидом, олигонуклеотидом, восстанавливающим устойчивость к ампициллину (Ampr), и олигонуклеотидом, придающим чувствительность к тетрациклину (Tets). Эти олигонуклеотиды служат затравками для синтеза ДНК с помощью ДНК-полимеразы Т4, а исходная цепь — матрицей. Одноцепочечные разрывы в новосинтезированной цепи зашиваются ДНК-лигазой Т4. Продуктами реакции трансформируют клетки E. coli и отбирают трансформантов Аmрг и TetS.

ДНК — матрицей. Одноцепочечные разрывы в новосинтезированной цепи зашиваются с помощью ДНК-лигазы Т4. По окончании синтеза и лигирования продуктами реакции трансформируют клетки E. coli. Трансформантов отбирают по признаку устойчивости к ампициллину и чувствительности к тетрациклину. Примерно 90% из них содержат специфическую мутацию в клонированном гене. У остальных трансформантов клонированный ген не был изменен либо потому, что олигонуклеотид не гибридизовался с ним, либо потому, что он вытеснялся в ходе синтеза ДНК. Клетки, несущие мутантный клонированный ген, идентифицируют с помощью гибридизации. Все плазмиды, штаммы, ферменты, олигонуклеотиды (кроме того, который предназначен для изменения клонированного гена), а также буферы продаются в наборе, что облегчает работу.
Олигонуклеотид-направленный мутагенез с использованием ПЦР-амплификации

Более простой и быстрый метод получения больших количеств мутантных генов, альтернативный системе с использованием фага М13, -сайт-специфический мутагенез в сочетании с полимеразной цепной реакцией (ПЦР), Один из вариантов этого подхода состоит в следующем.

Ген-мишень встраивают в плазмидный вектор и помешают препарат в две пробирки. В каждую из них добавляют по два специфических праймера для ПЦР: 1 и 2 в одну пробирку, 3 и 4 — в другую. Праймеры 2 и 3 полностью комплементарны одному из участков клонированного гена или прилегающей к нему последовательности, а 1 и 3 комплементарны другому участку, но содержат один некомплементарный нуклеотид и гибридизуются с разными цепями, так что в результате происходит замена обоих нуклеотидов данной пары. Положение сайтов гибридизации праймеров l и 2 в одной пробирке и 3 и 4 — в другой таково, что ΠЦР-продукты в разных пробирках имеют разные концы. По окончании ПЦР содержимое пробирок объединяют и проводят денатурацию, а затем ренатура-цию. Поскольку концы амплифицированных молекул ДНК из двух пробирок неодинаковы, одноцепочечные ДНК из разных пробирок ассоциируют с образованием кольцевых молекул с двумя одноцепочечными разрывами. Эти разрывы репарируются in vivo после трансформации E. coli. При ренатурации одиночных цепей из одной пробирки образуются линейные молекулы. В клетках E. coti стабильно поддерживаются в виде плазмид и наследуются только кольцевые, а не линейные молекулы, при этом все они несут сайт-специфическую мутацию. Таким образом, с помощью описанного метода можно вносить точковые мутации в клонированный ген, при этом отпадает необходимость во встраивании гена в ДНК фага M13, использовании мутантных штаммов Е. coli типа dut ung и в переносе мутантного гена из М13-вектора в экспрессирующий вектор.

18. Объясните, как можно повысить термостабильность белков и активность в организме хозяина методами генной инженерии.

В настоящее время идентифицировано около 2000 ферментов. Промышленностью выпускается около 250 наименований, причем 99% приходится только на 18 ферментов. Остальные ферменты не используются потому, что присущая им активность не удовлетворяет требованиям, предъявляемым высокоспециализированными процессами, протекающими in vitro. Большинство ферментов быстро денатурируют при высокой температуре и в присутствии органических растворителей, а именно в этих условиях протекают многие промышленные процессы. Термостабильность белковых молекул можно повысить, внеся в них изменения, благодаря которым они дольше не разворачиваются при повышении температуры. Кроме того, такие термостабильные белки часто не разрушаются в органических растворителях и при нефизиологических условиях (например, при экстремальных pH).

1 метод. Образование дополнительных дисульфидных связей. Проблема: К значительному повышению стабильности белковой молекулы может привести образование в ней дополнительных дисульфидных связей. Основная проблема здесь заключается в том, чтобы эти связи не мешали нормальному функционированию белка. Решение: При помощи олигонуклеотид-направленного мутагенеза были созданы шесть вариантов лизоцима фага Т4 с новыми внутри-цепочечными дисульфидными связями. Для этого два, четыре или шесть специфических аминокислотных остатков в полинуклеотидной цепи были заменены на остатки цистеина, в результате чего образовалась одна, две и три дисульфидных связи соответственно.
Результаты этого эксперимента показали, что термостабильность фермента повышается при образовании новых дисульфидных связей, при этом наиболее термостабильным является белок с максимальным числом таких связей. Однако некоторые варианты, будучи более термостабильными, чем нативный фермент, не обладают ферментативной активностью. Возможно, это обусловливается искажением конформации белковой молекулы при образовании дисульфидной связи между определенными аминокислотными остатками.

2 метод. Замена аспарагина на другие аминокислоты. Проблема: При высоких температурах остатки аспарагина и глутамина могут дезамидироваться с образованием аммиака. Теряя амидную группу, они превращаются в аспарагиновую и глутаминовую кислоты соответственно, что приводит к локальным изменениям конформации полипептидной цепи и как следствие — к утрате активности белков, в которые они входят. Решение: Триозофосфатизомераза состоит из двух идентичных субъединиц; каждая из них содержит два остатка аспарагина, замена которых может приводить к изменению термочувствительности белка, поскольку они расположены в месте соприкосновения субъединиц. При помощи олигонуклеотид-направленного мутагенеза были заменены остатки аспарагина в положениях 14 и 78. Замена одного из них на остаток треонина или изолейцина приводила к повышению термостабильности фермента, на аспарагиновую кислоту — к понижению. Фермент, получающийся при замене обоих остатков аспарагина на остатки аспарагиновой кислоты, оказался нестабильным даже при нормальной температуре и обладал низкой ферментативной активностью.

3 способ. Уменьшение числа свободных сульфгидрильных групп. Проблема: Чужеродный белок, синтезируемый в организме-хозяине, иногда оказывается менее активным, чем ожидалось. Например, при экспрессии в Е. coli клонированной комплементарной ДНК (кДНК) ß-интерферона человека (ИΦβ) белковый продукт обладал в 10 раз меньшей противовирусной активностью, чем нативная гликозилированная форма. При этом ИΦβ синтезировался в довольно большом количестве, однако почти все его молекулы образовывали димеры и более высокомолекулярные неактивные комплексы. Решение: в ß-интерфероне человека присутствуют три остатка цистеина, и один из них или несколько, возможно, участвуют в образовании дисульфидных связей, приводящих к образованию димеров и олигомеров в клетках E. coli, но не в клетках человека. Было высказано предположение, что замена одного или нескольких цистеиновых кодонов на сериновые приведет к синтезу интерферона, не образующего олигомеров. Серин был выбран потому, что его структура сходна со структурой цистеина за исключением того, что вместо серы он содержит кислород и поэтому не может образовывать дисульфидные связи. Исследователи не знали, какой из трех остатков цистеина был ответствен за формирование межмолекулярных дисульфидных связей. К счастью, локализация остатков цистеина, участвующих в образовании внутримолекулярных дисульфидных связей в молекуле ИФ-aльфа с аналогичной структурой, была известна, что делало возможным сравнение аминокислотных последовательностей этих двух молекул. Как показали результаты анализа, остатки Cys-31 и Cys-141 в ИΦβ находятся в тех же позициях, что и остатки Cys-29 и Cys-138 в ИФa. Поскольку последние участвуют в образовании в ИФa внутримолекулярных дисульфидных связей, было разумно предположить, что Cys-17 в ИΦβ не вовлечен в формирование таких связей и его можно заменить. Это предположение оказалось правильным: при синтезе в клетках Е. coli Ser-17-ИΦβ мультимерные комплексы не образовывались. Кроме того, этот интерферон обладал такой же удельной активностью, как и аутентичный нативный ИФβ, и был более стабилен при длительном хранении, чем нативная форма.

19. Объясните, как можно повысить ферментативную активность методами генной инженерии белков.

3 способ из 18 вопроса

И

Эксперимент по изменению специфичности связывания субстрата тирозил-тРНК—синтетазой. Этот фермент катализирует аминоацилирование тРНК, которая специфически связывает тирозин (тРНК^т>1), в ходе двухступенчатой реакции:

(1) Туг + АТР --> Туr-А + PP_i

(2) Туг-А + тРНК^Туг--> Туг-тРНК^Tyr +АМР

Ко времени постановки эксперимента была определена пространственная структура тирозил-тРНК—синтетазы и локализован ее активный центр, так что при помощи компьютерного моделирования можно было предсказать влияние замены в нем одного или нескольких аминокислотных остатков на взаимодействие фермента с субстратами.

С помощью олигонуклеотид-направленного мутагенеза в ген тирозил-тРНК—синтетазы были внесены специфические мутации. Остаток треонина в положении 51 (Thr-51) был заменен на остаток аланина или пролина. В нативном ферменте гидроксильная группа Thr-51 образует водородную связь с атомом кислорода рибозного кольца тирозиладенилата, и предполагалось, что разрыв этой слабой связи увеличит сродство фермента к АТР.
Чтобы охарактеризовать получившиеся ферменты, определили их кинетические константы. В некоторых случаях изменения оказались более существенными, чем ожидалось. Каталическая эффективность реакции аминоацилирования увеличилась в обоих случаях.
Результат, полученный для Рго-51-фермента. был неожиданным, поскольку замена треонина на пролин должна была привести к нарушению (по крайней мере локальному) структуры α-спирали в этой области, что предположительно должно отрицательно сказаться на связывании субстрата.
Эги данные показывают, что несмотря на всю сложность прогнозирования результата специфических аминокислотных замен, с помощью описанного подхода все же можно идентифицировать боковые группы, замена которых приведет к улучшению кинетических свойств фермента. Кроме того, стало очевидно, что сродство данного фермента к субстрату, а также каталитическую эффективность реакции можно повысить in vitro, внося соответствующие изменения в клонированный ген.