2020-04-12
831
Дифференциация и идентификация возбудителей (определение родовой, видовой и типовой принадлежности микроорганизмов) – наиболее ответственный этап микробиологического исследования. Он осуществляется на основании изучения целого комплекса свойств микроорганизмов: морфологических, тинкториальных, культуральных, ферментативных и антигенных.
Широкий спектр микроорганизмов, играющих роль в возникновении инфекционного процесса, требует изучения ферментативной активности выделенных микроорганизмов путем постановки большого количества различных биохимических реакций, позволяющих по сочетанию полученных результатов в комплексе с другими данными определить вид микроорганизма. Этот раздел работы наиболее трудоемкий, проводится в несколько этапов, требует приготовления большого количества питательных сред, дефицитных реактивов, посуды и т.д. При переходе от классических методов к современным ориентир следует смещать от многоступенчатых исследований к унифицированной процедуре с приданием большего значения стандартизации, ускорению, воспроизводимости, миниатюризации и автоматизации.
|
|
|
Коммерческие микротест-системы или слайды для биохимической идентификации микроорганизмов различных групп – это готовые к использованию полистироловые панели (или планшеты) с сухими дифференциальными средами. В нашей стране такие тест-системы производят в Ставрополе (ФГУП "Аллерген"), Махачкале (НПО "Питательные среды"), Нижнем Новгороде (НПО "Диагностические системы"), Санкт-Петербурге (НИИЭМ им.Л.Пастера). Достаточно известны в нашей стране диагностические панели API (фирма "bioMerieux", Франция), BBL Crystal (фирма "Becton Dickinson", США), тест-панели "Bio-Rad" (Франция), MICRO-LA-TEST (фирма "PLIVA-Lachema", Чехия) и др. для идентификации различных микроорганизмов.
Для работы широкого круга микробиологических лабораторий с практической точки зрения наилучшим образом себя зарекомендовали тест-системы мультимикротестов для биохимической идентификации энтеробактерий (ММТ El и ММТ Е2) и коринебактерий (ММТ D) производства ФГУП "Аллерген", а также диагностикумы MICRO-LA-TEST фирмы "PLIVA-Lachema" для идентификации широкого спектра возбудителей, ответственных за возникновение гнойно-воспалительных и инфекционных заболеваний (энтеробактерий и вибрионы, стафилококки, стрептококки, энтерококки, нефермен-тирующие грамотрицательные бактерии, анаэробы, нейссерии). Данные микротест-системы представляют собой цельнолитую или стрипованную (разделенную на 8-луночные стрипы) пластмассовую пластинку-планшет размером 8,5 х 12,5 см с 96 лунками. В лунках содержатся высушенные питательные среды и субстраты для биохимических реакций, которые растворяются после добавления суспензии микроорганизмов (инокулята испытуемых штаммов). Дифференциальные биохимические тесты-реакции в тест-системах подобраны таким образом, чтобы провести идентификацию наибольшего количества таксонов за один этап. В течение времени инкубации во время размноже ния микроорганизмов происходят биохимические реакции, результаты которых можно зарегистрировать либо визуально, либо при помощи приборов-фотометров по изменению цвета индикатора (рис. 17.1). В дальнейшем техника работы с тест-системами будет рассмотрена на примере указанных тест-систем.
|
|
|
17.1.1. Общие правила работы с микротест-системами для идентификации микроорганизмов
Методика проведения микробиологических исследований с использованием микротест-систем должна полностью соответствовать инструкциям, прилагаемым к каждому виду тест-систем. Качество тест-систем контролируют с помощью контрольных референтных бактериальных культур, перечень которых приводится в инструкциях к тест-системам. Тем не менее существует общий унифицированный подход к идентификации микроорганизмов при помощи микротест-систем, техника работы с которыми достаточно проста и состоит из следующих этапов.
Выделение культуры.
При идентификации микроорганизмов необходимо работать только с чистой культурой, поскольку присутствие посторонних микроорганизмов может исказить результаты исследования и послужить поводом для ошибочного заключения. Выделяют чистые культуры общепринятыми в микробиологии методами. Особое внимание следует уделять качеству питательных сред, используемых для выделения возбудителей инфекционного процесса. От этого зависят и количество идентифицируемых видов, и успех идентификации.
По результатам первичного посева и данных микроскопии проводится дифференциация культур на грамположительные и грамотрицательные кокки и палочки.
Приготовление бактериальной суспензии:
бактериальную суспензию готовят в суспензионной среде (прилагается к тест-системе или указывается в инструкции) из чистой 18–24-часовой культуры бактерий определенной степени мутности по стандарту МсFarland (для отечественных тест-систем – стандарт ОСО). Тщательно гомогенизируют суспензию. Слишком густая или жидкая суспензия может привести к ложным результатам;
параллельно делают контрольный высев суспензии культуры на кровяной агар для проверки чистоты культуры, ее ростовых свойств и(или) для постановки дополнительных тестов;
эту же суспензию используют для постановки дополнительных тестов с диагностическими полосками.1
Инокуляция:
суспензию бактерий тщательно встряхивают и в необходимом объеме (указывается в инструкции) инокулируют в ячейки в соответствии с инструкцией к тест-системе;
после инокуляции в определенные лунки для создания анаэробных условий добавляют стерильное вазелиновое (или парафиновое) масло.
Инкубация:
инокулированные тест-системы в полиэтиленовых пакетах или прикрытые крышками инкубируют в термостате при температуре 30–37 °С в течение 4–48 ч (в зависимости от вида тест-системы).
Оценка результатов:
по окончании инкубации проверяют чистоту культуры по контрольному посеву;
при отсутствии роста в лунках следует увеличить время (продолжительность) инкубации;
добавляют в определенные лунки необходимые реактивы;
учитывают результаты биохимических реакций визуально с помощью таблиц "Интерпретация реакций" и(или) цветовых шкал и заносят их в бланки.
Идентификация:
– идентификацию проводят с помощью таблиц биохимической активности, профильных индексов, диагностических регистров (книг кодов) или компьютерной программы.
|
|
|
При окончательной идентификации следует учитывать всю дополнительную информацию о культуре микроорганизма (микроскопию, характер роста колоний, наличие пигмента, подвижность, источник выделения и т. д.). При идентификации с помощью таблиц биохимической активности проводят поиск вида культуры с аналогичными результатами реакций. Такой метод пригоден и достаточно достоверен для групп с малым количеством тестов и таксонов. Идентификацию с использованием профильных индексов применяют для определения вида бактерий путем вычисления их цифрового профиля. Это позволяет проводить интерпретацию результатов по стандартной процедуре. В профильные индексы включено большинство возможных комбинаций тестов, с их использованием возможна идентификация типичных культур, включенных в "Идентификационную таблицу" тест-системы.
Методика расчета профиля культуры. Результаты срабатывания биохимических реакций переводят в цифровой код – профиль. Для этого всю последовательность тестов в тест-системе (от первого до последнего) разбивают на триады. В каждой из триад положительно сработавшим тестам присваивают числовые значения: первый тест в триаде –"1", второй тест в триаде – "2", третий тест в триаде – "4". Всем отрицательным результатам присваивается "0".
Суммируют числовые значения в триадах. Полученный числовой код соответствует профилю исследуемого микроорганизма.
Применение систем мультимикротестов ММТ El и ММТ Е2. Системы мультимикротестов ММТ El и ММТ Е2 предназначены для определения биохимической активности и последующей идентификации наиболее распространенных представителей семейства энтеробактерий и дифференциации их от некоторых бактерий из семейства вибрионов в течение 18–24 ч. ММТ El позволяет определить 12 ключевых тестов: образование сероводорода, индола, наличие лизиндекарбоксилазы, ор-нитиндекарбоксилазы, уреазы, фенилаланиндезаминазы, утилизация цитрата натрия, малоната натрия, маннитола, сахарозы, лактозы и сорбита. ММТ Е2 позволяет определить 12 дополнительных биохимических свойств, которые в сочетании с 12 ключевыми тестами, определяемыми в ММТ El, служат для видовой идентификации энтеробактерий: наличие арги-ниндегидролазы, бета-галактозидазы, нитратредуктазы, утилизация инозитола, дульцита, арабинозы, рамнозы, мальтозы, адонита, раффинозы, салицина, глюкозы.
|
|
|
Для идентификации используют чистую культуру со среды Эндо или кровяного агара. Ставят тест на ферментацию глюкозы (O/F-тест) на среде Хью–Лейфсона для установления принадлежности выделенной культуры к группе ферментирующих микроорганизмов и тест на оксидазу для дифференциации энтеробактерий от вибрионов и других оксидазоположи-тельных культур.
Применение микротест-системы ENTEROtest 24. ENTEROtest 24 предназначен для определения биохимической активности и идентификации наиболее важных для патологии человека микроорганизмов семейства энтеробактерий и дифференциации их от некоторых представителей семейства вибрионов в течение 18–24 ч. ENTEROtest 24 позволяет провести для каждой культуры 24 биохимических теста, размещенных в трехрядных стрипах (3×8 лунок): индол, сероводород, лизин, орнитин, уреаза, аргинин, цитрат Симмонса, малонат натрия, фенилаланин, бета-галактозидаза (ONPG), инозит, адонит, цел-лобиоза, сахароза, трегалоза, маннитол, ацетоин (Фогес– Про-скауэр), эскулин, рамноза, сорбитол, мелибиоза, раффиноза, дульцит, глюкоза.
Для идентификации используют чистую культуру со среды Эндо или кровяного агара. Ставят тест на ферментацию глюкозы (O/F-тест) на среде Хью–Лейфсона для установления принадлежности выделенной культуры к группе ферментирующих микроорганизмов и тест на оксидазу для дифференциации энтеробактерий от вибрионов и других оксидазоположи-тельных культур.
Применение микротест-системы ENTEROtest 16. ENTEROtest 16 предназначен для определения биохимической активности и последующей идентификации наиболее важных для патологии человека микроорганизмов семейства энтеробактерий в течение 18–24 ч. Система представляет собой двухрядный стрип (2×8 лунок) с высушенными питательными средами и реагентами для определения 16 ключевых тестов: сероводород, лизин, индол, орнитин, уреаза, фенилаланин, эскулин, цитрат Симмонса, малонат, инозит, адонит, целлобиоза, сахароза, сорбитол, трегалоза и маннитол. Идентификация должна быть дополнена тестами на бумажных полосках для определения цитохромоксидазы, бета-галактозидазы и продукции ацетоина (VP-тест).
Для идентификации используют чистую культуру со среды Эндо, кровяного агара или агара MacConkey. Следует также поставить тест на ферментацию глюкозы для установления факта принадлежности выделенной культуры к группе ферментирующих микроорганизмов. Ставят тест на выявление цитохромоксидазы с помощью полосок OXI-тест для выявления оксидазоположительных микроорганизмов из родов Aeromonas, Plesiomonas и Vibrio. Биохимическую идентификацию сальмонелл, шигелл и кишечной палочки, выделенной у больных с гастроэнтеритами, подтверждают серологически.
Ускоренные методы идентификации некоторых энтеробактерий
Применение микротест-системы ENTERO-Screen. ENTERO-Screen предназначен для ускоренной (в течение 4 ч) идентификации энтеробактерий, наиболее часто встречающихся при мочевых и других инфекциях, а также для выявления сальмонелл и кишечной палочки в санитарно-эпидемиологических исследованиях. Система представляет собой стрип (8 лунок) с субстратами для определения 8 ключевых тестов: глюкоза в анаэробных условиях, ацетоин, фенилаланин, индол, сахароза, уреаза, лизин, орнитин. Идентификация должна быть дополнена тестами на бумажных полосках: OXI-тест, PYR-тест на выявление пиразы, SALMtest для обнаружения присутствия сальмонелл и COLItest для обнаружения присутствия E.coli.
Для идентификации используют чистую культуру со среды Эндо, агара MacConkey, кровяного агара, ставят тест на цито-хромоксидазу (OXI-тест).
Следует обращать внимание на то, что некоторые культуры сальмонелл могут показывать отрицательную или замедленную реакцию в тестах на лизин или орнитин. В случае подозрения на принадлежность к роду сальмонелл выполняют расширенную идентификацию при помощи набора ENTEROtest 16 или ENTEROtest 24. Аналогично поступают с культурами, которые не удалось идентифицировать при помощи ENTERO-Screen. При окончательной идентификации учитывают всю дополнительную информацию (характер роста колоний, микроскопию, утилизацию лактозы, подвижность, источник выделения и т.д.). При отрицательном тесте ферментации глюкозы в анаэробных условиях можно предположить отнесение данной культуры к неферментирующим бактериям.
Применение микротест-системы ENTERO-Rapid 24. Набор ENTERO-Rapid 24 предназначен для быстрой идентификации наиболее важных для патологии человека энтеробактерий за 4 ч при помощи 24 тестов, размещенных в трехрядных стрипах (3x8 лунок): индол, лизин, орнитин, уреаза, сахароза, сорбитол, трегалоза, глюкоза, пираза, эскулин, целлобиоза, мелибиоза, салицин, манноза, мальтоза, раффиноза, ацетоин (Фогес– Проскауэр), фенилаланин, малонат натрия, бета-галактозидаза (ONPG), бета-глюкуронидаза, альфа-галактозидаза, бета-кси-лозидаза, ^ацетил-бета-О-глюкозаминидаза.
Использование диагностических полосок для ускоренной ориентировочной идентификации сальмонелл и кишечной палочки (SALMtest, COLItest). Диагностическая полоска SALMtest предназначена для обнаружения типичного для рода сальмонелл признака – активности фермента С8-эстеразы. Высокая чувствительность теста по отношению к роду сальмонелл вместе с несложной методикой выполнения и быстротой получения результатов реакции позволяют применить SALMtest в скринин-говых исследованиях для обнаружения сальмонелл не только в клинике, но и в пищевой промышленности и т.п.
Принцип действия SALMtest фермент С8-эстераза гидро-лизирует 4-метилумбеллиферил каприлат, содержащийся в тестовой зоне полоски. Освобожденный 4-метилумбеллиферрон под воздействием ультрафиолетовых лучей (применяется УФ-лампа с длиной волны испускаемого света около 360 нм) флюоресцирует синим светом, что регистрируется как положительная реакция.
Методика постановки SALMtest:
∆ для тестирования используют 24-часовую культуру, подозрительную на сальмонеллы, со среды Эндо, агара с бриллиантовым зеленым, агара МасСоnкеу, агара с эозин-метиленовым синим1;
∆ добавляют на тестовую зону полоски приблизительно 10 мкл специального реактива для SALMtest;
∆ при помощи микробиологической петли распределяют проверяемую культуру по зоне; в случае чистой культуры (или же достаточно хорошо изолированных друг от друга колоний на агаровой среде) можно снимать культуру с поверхности агара, приложив к ней непосредственно полоску;
∆ полоску инкубируют 10–15 мин при комнатной температуре;
∆ по истечении упомянутого времени учитывают реакцию под УФ-лампой; положительная реакция проявляется возникновением синей флюоресценции в зоне полоски;
∆ штаммы с положительной реакцией в последующем идентифицируют, например, при помощи набора ENTERO-Screen.
Примечания к методике постановки SALMtest:
∆ при проведении теста всегда используют отрицательный контроль: реактив добавляют на зону полоски и инкубируют без нанесения бактериальной культуры;
∆ считывание реакции под УФ-лампой выполняют в темноте, лучше всего в специальной установке, предназначенной для оценки флюоресценции (например, шкаф Гансена);
∆ несмотря на то, что SALMtest дает ложноположительные реакции у некоторых микроорганизмов, он дает положительный результат у 100 % сальмонелл.
Диагностические полоски СОLItest предназначены для быстрой идентификации кишечных палочек и дифференциации их от других грамотрицательных оксидазоотрицательных бактерий, выделенных из клинического материала, пищевых продуктов, воды и т.д. Идентификация основана на определении глюкуронидазной активности и образования индола. Результаты анализов учитываются через 4 ч инкубации в термостате.
Принцип метода: фермент бета-глюкуронидаза расщепляет 4-метилумбеллиферил-D-глюкуронид с высвобождением при этом 4-метилумбеллиферона, который в ультрафиолетовых лучах флюоресцирует голубым светом. Продукция индола из L-триптофана определяется по появлению красного окрашивания после добавления специфического реагента на индол (р-диметиламинобензальдегид).
Методика постановки СОLItest:
∆ для проведения исследования используют культуру коли-формных бактерий и(или) грамотрицательных оксидазоот-рицательных палочек;
∆ готовят 0,5–1,0 мл суспензии тестируемого микроорганизма в стерильном физиологическом растворе, мутность суспензии должна соответствовать номеру 3 по шкале McFarland;
∆ помещают полоску СОLItest в пробирку с суспензией (бумажная зона полоски должна быть полностью погружена в суспензию);
∆ инкубируют пробирки с полосками при температуре 37°С в течение 4 ч (предварительный результат теста на глюку-ронидазную активность может быть получен через 1 ч).
Учет результатов:
∆ сначала учитывают результаты глюкуронидазной реакции в темном месте с использованием УФ-лампы (длина волны 360 нм);
∆ затем в пробирку с суспензией добавляют 4–5 капель реактива на индол.
Оценка результатов:
у типичных штаммов кишечной палочки – глюкуронидаза (+), индол (+). У некоторых штаммов кишечной палочки может быть глюкуронидаза (–), индол (+) или глюкуронидаза (+), индол (–). Такие штаммы подлежат дальнейшей идентификации при помощи микротест-систем1.
Идентификация неферментирующих микроорганизмов при помощи микротест-системы при помощи микротест-системы NEFERMtest 24. NEFERMtest 24 предназначен для биохимической идентификации грамотрицательных неферментирующих бактерий, прежде всего из клинического материала. При помощи этой тест-системы можно также выполнить идентификацию встречающихся в клинической практике представителей ферментирующих оксидазоположи-тельных грамотрицательных палочек. Тест-система представляет собой трехрядный стрип (3x8 лунок) с субстратами для проведения 24 тестов: индол, аргинин, уреаза, лизин, глюкоза, фруктоза, инозитол, сахароза, фосфатаза, бета-галактозидаза, бета-глюкозидаза, М-ацетил-бета-Б-глюкозаминидаза, манни-тол, ксилоза, целлобиоза, галактоза, нитраты, нитриты, эскулин, гамма-глутамилтрансфераза, лактоза, мальтоза, трегалоза и цитрат Симмонса.
Чистую культуру следует выделять на кровяном агаре (агар с кровью барана). С чистой 24-часовой культурой ставят тест на выявление цитохромоксидазы (полоска OXI-тест). При окончательной идентификации следует учитывать всю дополнительную информацию (источник выделения бактерий, характер роста колоний, микроскопию и другие характеристики: наличие пигмента или флюоресценции, рост при температуре 42 °С, гемолиз, рост на агаре MacConkey, наличие каталазной активности, подвижности, гидролиза желатина, результаты O/F-теста).
Идентификация стафилококков при помощи микротест-системы STAPHYtest 16. STAPHYtest 16 предназначен для быстрого и надежного отличения стафилококков от других грамположительных кокков (Micrococcus, Stomatococcus и Aerococcus), простой и быстрой идентификации клинически важных видов стафилококков. Тест-система представляет собой двухрядный вертикальный стрип (2x8 лунок) с субстратами для проведения 16 тестов: уреаза, аргинин, орнитин, бета-галактозидаза, бета-глюкуронидаза, нитраты, фосфатаза, пирролидониларила-мидаза, эскулин, сахароза, трегалоза, маннитол, ксилоза, мальтоза, манноза, глюкоза/новобиоцин. Дополнительно следует использовать бумажные полоски для определения ацетоина (VP-тест) и определения цитохромоксидазы (OXI-тест).
Выделяют чистую культуру на кровяном агаре в соответствии с инструкцией к тест-системе.
Идентификация стрептококков при помощи микротест-системы STREPTOtest 16. STREPTOtest 16 предназначен для определения биохимической активности и идентификации стрептококков по 16 биохимическим тестам, расположенным в двухрядном стрипе (2x8 лунок): гиппурат, фосфатаза, лейцинами-нопептидаза, бета-глюкуронидаза, альфа-галактозидаза, эскулин, аргинин, уреаза, маннитол, сорбитол, трегалоза, лактоза, раффиноза, инулин, мелибиоза и рибоза. Идентификацию следует дополнить тестами на бумажных полосках для выявления пирролидонилариламидазы и образования ацетоина.
Чистую культуру выделяют на агаре с кровью барана. Инкубацию посевов производят в атмосфере с содержанием 5 % углекислого газа. Для выявления каталазной активности микроорганизмов ставят тест на предметном стекле с 3 % раствором перекиси водорода.
При окончательной идентификации следует учитывать всю дополнительную информацию о культуре (микроскопию, характер роста колоний, наличие пигментообразования, гемолиз, источник выделения и т.д.).
Идентификация энтерококков при помощи микротест-системы EN-COCCUStest. EN-COCCUStest позволяет идентифицировать клинически значимые виды энтерококков при помощи восьми биохимических тестов (стрип из 8 лунок): аргинин, сорбоза, арабиноза, маннитол, сорбитол, мелибиоза, раффиноза и мелецитоза. Для выявления типичного для энтерококков теста – активности пирролидонилариламидазы – следует использовать тест-полоску PYR-тест.
Для идентификации используют чистую культуру, выращенную на агаре с кровью барана. Ставят другие тесты для подтверждения принадлежности изолята к роду энтерококков. При окончательной идентификации следует учитывать всю дополнительную информацию (источник выделения, микроскопию, характер роста колоний и т.д.). Образование желтого пигмента и подвижность являются важными признаками при идентификации энтерококков.
Идентификация нейссерий при помощи микротест-системы NEISSERIAtest. Тест-система NEISSERIAtest предназначена для определения биохимической активности оксидазоположи-тельных, грамотрицательных кокков и коккобацилл, позволяет идентифицировать патогенные нейссерий (N.gonorrhoeae, N.meningitidis) и Moraxella (Branhamella) catarrhalis и дифференцировать их от сапрофитирующих нейссерий. Тест-система содержит субстраты для определения 7 ключевых биохимических тестов (один стрип из 8 лунок): глюкоза, мальтоза, фруктоза, сахароза, гамма-глутамилтрансфераза, трибутирин, синтез полисахаридов. 8-я лунка стрипа содержит высушенную питательную среду для постановки контроля. Дополнительно следует провести тест на наличие бета-галактозидазы (при помощи полоски ONP-тест).
Чистую культуру следует выделять на шоколадном агаре или сывороточном агаре. Чашки с агаром перед посевом нагревают до 35–37 °С. Чашки после посева инкубируют при повышенном содержании углекислого газа и в атмосфере повышенной влажности воздуха при температуре 35–37°С в течение 18–24 ч. Из чистой культуры делают мазок, окрашивают по Граму и микроскопируют, ставят тесты на наличие оксидазы и ката-лазы. Грамотрицательные кокки и диплококки с положительной реакцией на оксидазу и каталазу следует идентифицировать с помощью NESSERIAtest (исключение составляет N.elongata, представляющая собой каталазоотрицательную палочку).
При окончательной идентификации следует учитывать всю дополнительную информацию (микроскопию, характер роста колоний, гемолиз, пигментацию и т.д.).
Идентификация коринебактерий при помощи микротест-системы ММТ D. Тест-система предназначена для определения биохимической активности и определения токсигенности коринебактерий дифтерии и дифференциации их от других коринебактерий, встречающихся в клиническом материале. Тест-система содержит субстраты для определения 5 ключевых биохимических тестов: глюкоза, сахароза, крахмал, уреаза, нитраты – и диагностические бумажные диски для определения токсигенности.
Чистую культуру выделяют на среде мартеновский агар или питательный агар с добавлением 20 % сыворотки крупного рогатого скота или нормальной лошадиной сыворотки.
Учитывают результаты планшетных тестов и теста на ток-сигенность. Идентификацию следует проводить с учетом данных по характеру роста, морфологии колоний, микроскопии, наличия цистиназы (проба Пизу), источников изоляции и др.
Идентификация анаэробов при помощи микротест-системы ANAEROtest 23. ANAEROtest 23 предназначен для биохимической идентификации анаэробных бактерий, прежде всего из клинического материала и из пищевых продуктов. Тест-система представляет собой тройной стрип (3x8 лунок) с реагентами для проведения 23 тестов: индол, глюкоза, мальтоза, фруктоза, галактоза, лактоза, мелецитоза, уреаза, нитраты, сахароза, салицин, трегалоза, маннитол, рамноза, N-ацетил-бета-D-глюко-заминидаза, бета-глюкозидаза, эскулин, манноза, раффиноза, целлобиоза, ксилоза, арабиноза и сорбитол.
Выделяют чистую культуру с использованием сред, рекомендованных для изоляции и культивирования анаэробных бактерий, например агар Wilkins-Chalgren. Из чистой культуры готовят мазок и окрашивают по Граму, учитывают морфологию (форму и агрегацию клеток, наличие спорообразования). Окраску по Граму в сомнительных случаях можно дополнить тестом со щелочью (3 % раствор КОН). Грамположительные палочки следует проверить на терморезистентность (выдерживание в течение 15 мин при температуре 80 °С). Для контроля проводят культивирование каждого штамма в аэробных условиях.
Особенности приготовления бактериальной суспензии и инокуляции планшета:
• в соответствии с инструкцией к тест-системе из чистой 48-часовой культуры следует приготовить суспензию в суспензионной среде для ANAEROtest 23. Мутность суспензии должна соответствовать номеру 3 по стандарту мутности Мсrland. При гомогенизации ампулу с суспензионной средой держат в вертикальном положении и двигают петлей по ее внутренней поверхности, предупреждая попадание воздуха в суспензионную среду. Инокулирование тест-системы не должно превышать 20 мин.
ANAEROtest 23 следует инкубировать с индикатором анаэробной атмосферы.
Идентификация. По микроскопии относят идентифицируемую анаэробную культуру к одной из четырех групп:
∆ грамотрицательные палочки;
∆грамположительные спорообразующие палочки;
∆ грамположительные неспорообразующие палочки;
∆ кокки.
При окончательной идентификации анаэробных бактерий следует учитывать всю дополнительную информацию (источник выделения, характер роста колоний, результаты тестов на патогенность и токсигенность, а также другие характеристики).
Наиболее частые причины неудач при идентификации микроорганизмов с использованием коммерческих микротест-систем следующие:
∆ наличие смешанной культуры;
∆использование суспензий микроорганизмов с недостаточной мутностью или в недостаточном объеме;
∆ перекрестная контаминация суспензий в расположенных рядом лунках;
∆ соответствующие лунки не заполнены парафиновым маслом;
∆ попадание реактивов в лунки соседнего ряда; Д нарушение инструкции к тест-системе при проведении исследования;
∆ недостижение анаэробной атмосферы при культивировании
анаэробных бактерий;
∆ возможно выделение штамма с нетипичными свойствами или
его данные не заложены в идентификационные таблицы.
17.1.2. Применение микротест-систем для оценки антибиотикочувствительности
Оценка антибиотикочувствительности микроорганизмов требует тщательной стандартизации всех этапов исследования, наличия качественных питательных сред и антибиотиков (это относится как к методу серийных разведений, так и к диско-диффузионному методу). Одним из удобных и достаточно экономичных путей преодоления описанных проблем является использование готовых микротест-систем, действие которых основано на принципе метода серийных микроразведений в варианте пограничных концентраций (тест пограничных концентраций – ТПК). Их применение избавляет от проведения наиболее трудоемких подготовительных этапов исследования (приготовления и стандартизации питательных сред с растворами антибиотиков), врач получает возможность сконцентрировать свое внимание на получении чистой культуры микроорганизма и стандартизации суспензии. В Государственном научном центре по антибиотикам (ГНЦА, Москва) выпускаются тест-системы ТПКтест, которые разработаны на основе стандартных 96-луночных планшетов, что позволяет проводить как визуальный учет результатов, так и автоматизированный с использованием планшетных фотометров.
ТПК-тест – это микротест-система однократного применения, позволяющая определить чувствительность четырех исследуемых микроорганизмов одновременно к 11 или 12 антибиотикам Или шести микроорганизмов к 8 антибиотикам. В настоящее время выпускаются 5 типов тест-систем с оптимальными наборами антибиотиков для групп микроорганизмов: энтеробактерий, грамположительных бактерий, псевдомонад, возбудителей уроинфекций, стафилококков. ТПКтест (рис. 17.2) представляет собой полистироловый планшет (8x12 лунок), в котором содержатся 4 или 6 аналогичных наборов высушенных растворов антибиотиков в питательной среде. Каждый антибиотик представлен двумя пограничными концентрациями, позволяющими дифференцировать микроорганизмы по степени чувствительности на три категории: "чувствительные", "умеренно-устойчивые" и "устойчивые". Большая концентрация соответствует минимальному значению МПК (минимальная подавляющая рост микроба концентрация) для устойчивых штаммов, малая концентрация соответствует максимальному значению МПК для чувствительных штаммов.
