Автоматизация и компьютеризация в микробиологии

17.2.1. Автоматизация при идентификации и определении антибиотикочувствительности

Компьютеризация и автоматизация идентификации микроорганизмов. Опыт применения микротест-систем в практической работе показал, что заключительный этап исследований – проведение идентификации культур с использованием рекомендованных идентификационных таблиц, индексов часто занимает много времени и не всегда приводит к положительному результату, так как невозможно предусмотреть все варианты ферментативной активности клинических штаммов микроорганизмов. Разработанные к некоторым тест-системам печатные книги кодов (регистры) позволяют расширить количество идентифифицируемых культур, выполнить ряд требуемых дополнительных тестов. Однако использование данных регистров требует много времени для подсчета числового кода, особенно при наличии сомнительных тестов. Единственный путь преодоления указанных трудностей – это использование компьютерных идентификационных программ и автоматизированных комплексов.

Для идентификации микроорганизмов различных групп можно использовать программу "Система микробиологического мониторинга МИКРОБ" ("Медпроект-3", Россия), позволяющую проводить визуальное считывание результатов биохимических тестов, выполненных с использованием коммерческих микротест-систем, детально описанных в предыдущем разделе, а также программу "БАКТ" ("Аналитика", Россия) для автоматического считывания результатов с помощью планшетных фотометров-ридеров типа Multiskan или iEMS (производства фирмы "THERMO Labsystems", Финляндия).

Преимуществом использования программ является возможность расширения числа идентифицируемых видов микроорганизмов, спектра изучаемых признаков (тестов), получения стандартных, воспроизводимых и сопоставимых результатов и получение готового бланка анализа. Идентификация микроорганизмов в программах основана на изучении морфологических, культуральных свойств и биохимической активности с использованием микротест-систем, позволяющих одновременно определить от 7 до 24 различных ферментативных реакций и более. Для этого на каждую группу микроорганизмов составлен "банк" данных, представляющий собой обобщенные сведения о частоте встречаемости того или иного теста у микроорганизмов различных видов. При составлении "банков" использованы литературные данные и данные собственных исследований разработчиков, позволяющие учесть особенности клинических штаммов и тест-систем. Для всех групп микроорганизмов спектр тестов, приведенных в "банках" данных, достаточно широк, он не ограничивается только биохимическими тестами, а включает данные по микроскопии (что особенно важно для анаэробов), рост на дифференциально-диагностических средах, наличие гемолиза, подвижность культур, наличие пигмента и т.д. Программы позволяют проводить идентификацию около 400 видов микроорганизмов, включающих представителей из семейств энтеробактерий и вибрионов, рода стафилококков и родственных грамположительных кокков, стрептококков, энтерококков, неферментирующих грамотрицательных бактерий, нейссерий, пастерелл, коринебактерий, анаэробов, клинически значимых грибов.

Идентификацию при помощи компьютерной программы начинают с выбора нужного "банка" данных микроорганизмов. В программе "МИКРОБ", например, на экране появится всплывающее меню с полным списком "банков".

При выборе из списка банка "Неферментирующие" появляется экранная форма с перечнем всех тестов, заложенных в банк данных на эту группу микроорганизмов.

При проведении идентификации визуально учитывают результаты выполненных тестов в тест-системе, на диагностических полосках и результаты дополнительных тестов (морфология, рост на среде Эндо, гемолиз, подвижность, ферментация глюкозы, наличие оксидазы, пигментообразования и др.), отмечая их "+" при положительной реакции, "–" при отрицательной и "?" при нечеткой реакции. После завершения ввода результатов тестов программа автоматически проводит расчет результатов идентификации и выдает на экран компьютера следующую информацию:

наименование наиболее вероятного (вероятных) микроорганизма из имеющихся в "банке" данных;

подобие или вероятность (%ид, %id);

индекс (Тин, Tin);

качественная оценка идентификации (определяется соотношением %ид и Тин):

Отличная                              %ид 99,9 и более, Тин 0,75 и более

 

Очень хорошая                    %ид 99,0 и более, Тин 0,50 и более

 

Хорошая                               %ид 90,0 и более, Тин 0,25 и более

 

Приемлемая                         %ид 85,0 и более, Тин 0,10 и более

 

– данные о несовпадающих (атипичных) тестах в полученном профиле для каждого из вероятных таксонов с процентом положительных реакций, заложенных в банке данных;

идентификация до рода или группы микроорганизмов одного рода – в случае неудовлетворительной идентификации для каждого из выбранных таксонов, но дающих в сумме для двух и более таксонов одного родового наименования удовлетворительные показатели.

Следует обращать особое внимание на те случаи, когда в таблице результатов идентификации появляются редко встречающиеся виды бактерий, причем для них нет ни одного не совпадающего с банком данных теста. В этих случаях рекомендуется повторить исследования, приготовив суспензию из культуры, выращенной из отдельной колонии на неселективной среде, полностью исключив возможность присутствия примеси посторонних микроорганизмов, особенно медленнорастущих.

Программа "БАКТ" наряду с введением результатов срабатывания тестов с клавиатуры позволяет проводить их автоматизированное считывание при помощи прибора. Однако результаты дополнительных тестов необходимо вносить вручную с клавиатуры.

При большом объеме выполняемых исследований визуаль ное считывание биохимических тестов и внесение их вручную для компьютерной идентификации следует заменить на автоматическое с использованием специализированных приборов. Внедрение в работу микробиологических лабораторий автоматического или полуавтоматического оборудования для выполнения ежедневных, самых трудоемких и дорогостоящих, исследований по идентификации и определению антибиотикочувст-вительности позволяет получать стандартные результаты, существенно сокращает сроки выдачи результатов анализов, устраняет малопроизводительный ручной труд.

В настоящее время для автоматизированного считывания тест-панелей предлагается несколько видов автоматизированных систем преимущественно зарубежного производства: полуавтоматическая, miniAPI и автоматическая VITEK (фирма "bioMerieux", Франция); полуавтоматическая Sceptor и автоматическая Phoenix (фирма "Becton Dickinson", США); полуавтоматическая AutoScan 4 и автоматическая WalkAway (фирма "Baxter/DADE", США); полуавтоматическая MicroTax (фирма "SyLab", Австрия); полуавтоматические на базе приборов Multiskan и iEMS (фирма "THERMO Labsystems"). Следует отметить, что планшетные фотометры, например фирмы "THERMO Labsystems", легко адаптируются как к отечественным, так и к импортным тест-системам стандартного планшетного 96-луночного формата для проведения идентификации микроорганизмов и определения антибиотикочувствительности. Это не создает безвыходных ситуаций в случае отсутствия адекватного финансирования, оставляет возможность выбора используемых тест-систем, исходя из их качества, цены и доступности.

17.2.2. Методы автоматизированного определения антибиотикочувствительности с использованием готовых тест-систем

 

При наличии прибора – планшетного фотометра, компьютера и программы "БАКТ" можно в автоматизированном режиме определять антибиотикочувствительность микроорганизмов двумя методами:

с количественной регистрацией результатов – определение минимальной ингибирующей концентрации (МИКтест);

полуколичественной регистрацией результатов – определение пограничных концентраций (ТПКтест или Breakpointtest)

Для определения антибиотикочувствительности при этом используют готовые к употреблению тест-системы (ТПКтест или МИКтест) со стандартным набором антибиотиков для различных групп бактерий. После автоматизированного считывания тест-систем ТПКтест программа "БАКТ" позволяет получить результаты в виде готовых печатных форм с указанием степени чувствительности выделенной культуры к каждому препарату в антибиотикограмме. При автоматизированном определении минимальной ингибирующей концентрации с помощью тест-системы МИКтест программа "БАКТ" позволяет получить для выделенной культуры точное значение МПК по каждому из препаратов, входящих в тест-систему.

17.2.3. Автоматизация определения степени обсемененности различных биоматериалов

Наличие в микробиологических лабораториях приборов, позволяющих снимать кинетику размножения микроорганизмов, позволяет решать широкий круг задач, например определять степень обсемененности биоматериалов для подтверждения этиологической значимости выделенных микроорганизмов. В настоящее время прибором, отвечающим всем требованиям для проведения кинетических измерений, является планшетный фотометр типа iЕМБ (рис. 17.6). Прибор имеет встроенный термостат, обеспечивающий поддержание температуры с точностью до 0,5°С и градиентом температуры по инкубируемому в приборе планшету 0,2 °С, 8 светофильтров с длинами волн 340, 405, 414, 450, 492, 540, 620, 690 нм и встроенный орбитальный встряхиватель-шейкер. Управление работой прибора осуществляется при помощи персонального компьютера и программы "БАКТ". Система охлаждения термостата прибора сконструирована таким образом, чтобы не происходило конта-минирования питательного бульона, внесенного в лунки планшета, из окружающей атмосферы при кинетических измерениях открытого планшета.

Известно, что характерное приращение оптической плотности инокулиро-ванной питательной среды свидетельствует о размножении в ней микроорганизмов. Высокий уровень корреляции оптической плотности с количеством микробных тел позволяет опосредованно "кривую роста оптической плотности" называть "кривой микробного роста". Для получения кривых микробного роста необходимо провести динамическое измерение оптической плотности в лунках планшета через равные промежутки времени при определенных длинах волн фотомет-рирования. При проведении динамических измерений на экране монитора высвечивается время вступления микроорганизмов биосубстрата в стадию экспоненциального роста. Установлено, что этот показатель тесно коррелирует с исходным количеством микроорганизмов практически в любом биосубстрате; при исходной обсемененности 108–109 микрооганизмов в 1 мл время вступления в фазу экспоненциального роста равняется 15–30 мин. Методика позволяет в течение первых 5 ч выявить пробы с исходной обсемененностью более 105 КОЕ/мл. Для этого на протяжении указанного периода времени, не прерывая динамического измерения, программа выдает на экран монитора номера лунок планшета, в которых микроорганизмы вступили в фазу экспоненциального роста, что свидетельствует о высокой обсемененности проб биоматериалов. Необходимо сделать высев этих проб на плотные питательные среды для получения чистой культуры, с тем чтобы уже на следующие сутки была возможность провести идентификацию выделенных культур и определить их антибиотикочувствительность.

По окончании проведения динамического измерения оптической плотности в лунках планшета (через 15–20 ч) программа "БАКТ" позволяет получить полные кривые роста микроорганизмов, присутствующих в биоматериале, в разведениях биоматериала 1:10, 1:100 и 1:1000

Для проведения исследования моча, раневое отделяемое и другие биосубстраты разводятся микротитрованием непосредственно в стандартном стерильном 96-луночном планшете в питательном бульоне; в одном планшете одновременно можно определить степень обсемененности 31 пробы различных биосубстратов. Специальный алгоритм математической обработки кинетических моделей роста микроорганизмов позволяет определять степень обсемененности мочи, раневого отделяемого и других биологических жидкостей. Через 15–20 ч инкубирования программа рассчитывает точное количество микроорганизмов в пересчете на 1 мл/г/см2 биосубстрата.

Данный метод позволяет обследовать одновременно большое количество больных при низких материальных и трудовых затратах по сравнению с традиционными количественными и полуколичественными методами. Получаемое при этом точное количество микроорганизмов может служить тестом при проведении мониторинга эффективности назначенной антибактериальной терапии.

Иллюстрации по теме

17.2. Автоматизация и компьютеризация в микробиологии

17.2.1. Автоматизация при идентификации и определении антибиотикочувствительности

 

Компьютеризация и автоматизация идентификации микроорганизмов. Опыт применения микротест-систем в практической работе показал, что заключительный этап исследований – проведение идентификации культур с использованием рекомендованных идентификационных таблиц, индексов часто занимает много времени и не всегда приводит к положительному результату, так как невозможно предусмотреть все варианты ферментативной активности клинических штаммов микроорганизмов. Разработанные к некоторым тест-системам печатные книги кодов (регистры) позволяют расширить количество идентифифицируемых культур, выполнить ряд требуемых дополнительных

 

тестов. Однако использование данных регистров требует много времени для подсчета числового кода, особенно при наличии сомнительных тестов. Единственный путь преодоления указанных трудностей – это использование компьютерных идентификационных программ и автоматизированных комплексов.

 

Для идентификации микроорганизмов различных групп можно использовать программу "Система микробиологического мониторинга МИКРОБ" ("Медпроект-3", Россия), позволяющую проводить визуальное считывание результатов биохимических тестов, выполненных с использованием коммерческих микротест-систем, детально описанных в предыдущем разделе, а также программу "БАКТ" ("Аналитика", Россия) для автоматического считывания результатов с помощью планшетных фотометров-ридеров типа Multiskan или iEMS (производства фирмы "THERMO Labsystems", Финляндия).

 

Преимуществом использования программ является возможность расширения числа идентифицируемых видов микроорганизмов, спектра изучаемых признаков (тестов), получения стандартных, воспроизводимых и сопоставимых результатов и получение готового бланка анализа. Идентификация микроорганизмов в программах основана на изучении морфологических, культуральных свойств и биохимической активности с использованием микротест-систем, позволяющих одновременно определить от 7 до 24 различных ферментативных реакций и более. Для этого на каждую группу микроорганизмов составлен "банк" данных, представляющий собой обобщенные сведения о частоте встречаемости того или иного теста у микроорганизмов различных видов. При составлении "банков" использованы литературные данные и данные собственных исследований разработчиков, позволяющие учесть особенности клинических штаммов и тест-систем. Для всех групп микроорганизмов спектр тестов, приведенных в "банках" данных, достаточно широк, он не ограничивается только биохимическими тестами, а включает данные по микроскопии (что особенно важно для анаэробов), рост на дифференциально-диагностических средах, наличие гемолиза, подвижность культур, наличие пигмента и т.д. Программы позволяют проводить идентификацию около 400 видов микроорганизмов, включающих представителей из семейств энтеробактерий и вибрионов, рода стафилококков и родственных грамположительных кокков, стрептококков, энтерококков, неферментирующих грамотрицательных бактерий, нейссерий, пастерелл, коринебактерий, анаэробов, клинически значимых грибов.

 

Идентификацию при помощи компьютерной программы начинают с выбора нужного "банка" данных микроорганизмов. В программе "МИКРОБ", например, на экране появится всплывающее меню с полным списком "банков".

 

При выборе из списка банка "Неферментирующие" появляется экранная форма с перечнем всех тестов, заложенных в банк данных на эту группу микроорганизмов (рис. 17.3).

 

 

        

Рис. 17.3. Идентификация в программе "МИКРОБ". Бланк для ввода результатов идентификации.

 

Над полями для ввода результатов срабатывания тестов даны их условные трехбуквенные обозначения.

 

При проведении идентификации визуально учитывают результаты выполненных тестов в тест-системе, на диагностических полосках и результаты дополнительных тестов (морфология, рост на среде Эндо, гемолиз, подвижность, ферментация глюкозы, наличие оксидазы, пигментообразования и др.), отмечая их "+" при положительной реакции, "–" при отрицательной и "?" при нечеткой реакции. После завершения ввода результатов тестов программа автоматически проводит расчет результатов идентификации и выдает на экран компьютера следующую информацию (рис. 17.4):

 

наименование наиболее вероятного (вероятных) микроорганизма из имеющихся в "банке" данных;

подобие или вероятность (%ид, %id);

индекс (Тин, Tin);

качественная оценка идентификации (определяется соотношением %ид и Тин):

Отличная                              %ид 99,9 и более, Тин 0,75 и более

 

Очень хорошая                    %ид 99,0 и более, Тин 0,50 и более

 

Хорошая                               %ид 90,0 и более, Тин 0,25 и более

 

Приемлемая                         %ид 85,0 и более, Тин 0,10 и более

 

– данные о несовпадающих (атипичных) тестах в полученном профиле для каждого из вероятных таксонов с процентом положительных реакций, заложенных в банке данных;

 

 

        

Рис. 17.4. Результат идентификации в программе "МИКРОБ". Идентифицированные культуры.

 

перечень дополнительных разделительных тестов в случае получения двух и более вероятных культур с указанием процента положительных реакций для каждого теста и таксона (рис. 17.5);

идентификация до рода или группы микроорганизмов одного рода – в случае неудовлетворительной идентификации для каждого из выбранных таксонов, но дающих в сумме для двух и более таксонов одного родового наименования удовлетворительные показатели.

Следует обращать особое внимание на те случаи, когда в таблице результатов идентификации появляются редко встречающиеся виды бактерий, причем для них нет ни одного не совпадающего с банком данных теста. В этих случаях рекомендуется повторить исследования, приготовив суспензию из культуры, выращенной из отдельной колонии на неселективной среде, полностью исключив возможность присутствия примеси посторонних микроорганизмов, особенно медленнорастущих.

 

Программа "БАКТ" наряду с введением результатов срабатывания тестов с клавиатуры позволяет проводить их автоматизированное считывание при помощи прибора. Однако результаты дополнительных тестов необходимо вносить вручную с клавиатуры.

 

При большом объеме выполняемых исследований визуаль ное считывание биохимических тестов и внесение их вручную для компьютерной идентификации следует заменить на автоматическое с использованием специализированных приборов. Внедрение в работу микробиологических лабораторий автоматического или полуавтоматического оборудования для выполнения ежедневных, самых трудоемких и дорогостоящих, исследований по идентификации и определению антибиотикочувст-вительности позволяет получать стандартные результаты, существенно сокращает сроки выдачи результатов анализов, устраняет малопроизводительный ручной труд.

 

 

        

Рис. 17.5. Результат идентификации в программе "МИКРОБ". Дополнительные тесты для разделения культур.

 

В настоящее время для автоматизированного считывания тест-панелей предлагается несколько видов автоматизированных систем преимущественно зарубежного производства: полуавтоматическая, miniAPI и автоматическая VITEK (фирма "bioMerieux", Франция); полуавтоматическая Sceptor и автоматическая Phoenix (фирма "Becton Dickinson", США); полуавтоматическая AutoScan 4 и автоматическая WalkAway (фирма "Baxter/DADE", США); полуавтоматическая MicroTax (фирма "SyLab", Австрия); полуавтоматические на базе приборов Multiskan и iEMS (фирма "THERMO Labsystems"). Следует отметить, что планшетные фотометры, например фирмы "THERMO Labsystems", легко адаптируются как к отечественным, так и к импортным тест-системам стандартного планшетного 96-луночного формата для проведения идентификации микроорганизмов и определения антибиотикочувствительности. Это не создает безвыходных ситуаций в случае отсутствия адекватного финансирования, оставляет возможность выбора используемых тест-систем, исходя из их качества, цены и доступности.

 

17.2.2. Методы автоматизированного определения антибиотикочувствительности с использованием готовых тест-систем

 

При наличии прибора – планшетного фотометра, компьютера и программы "БАКТ" можно в автоматизированном режиме определять антибиотикочувствительность микроорганизмов двумя методами:

 

с количественной регистрацией результатов – определение минимальной ингибирующей концентрации (МИКтест);

полуколичественной регистрацией результатов – определение пограничных концентраций (ТПКтест или Breakpointtest)

Для определения антибиотикочувствительности при этом используют готовые к употреблению тест-системы (ТПКтест или МИКтест) со стандартным набором антибиотиков для различных групп бактерий. После автоматизированного считывания тест-систем ТПКтест программа "БАКТ" позволяет получить результаты в виде готовых печатных форм с указанием степени чувствительности выделенной культуры к каждому препарату в антибиотикограмме. При автоматизированном определении минимальной ингибирующей концентрации с помощью тест-системы МИКтест программа "БАКТ" позволяет получить для выделенной культуры точное значение МПК по каждому из препаратов, входящих в тест-систему.

 

17.2.3. Автоматизация определения степени обсемененности различных биоматериалов

 

Наличие в микробиологических лабораториях приборов, позволяющих снимать кинетику размножения микроорганизмов, позволяет решать широкий круг задач, например определять степень обсемененности биоматериалов для подтверждения этиологической значимости выделенных микроорганизмов. В настоящее время прибором, отвечающим всем требованиям для проведения кинетических измерений, является планшетный фотометр типа iЕМБ (рис. 17.6). Прибор имеет встроенный термостат, обеспечивающий поддержание температуры с точностью до 0,5°С и градиентом температуры по инкубируемому в приборе планшету 0,2 °С, 8 светофильтров с длинами волн 340, 405, 414, 450, 492, 540, 620, 690 нм и встроенный орбитальный встряхиватель-шейкер. Управление работой прибора осуществляется при помощи персонального компьютера и программы "БАКТ". Система охлаждения термостата прибора сконструирована таким образом, чтобы не происходило конта-минирования питательного бульона, внесенного в лунки планшета, из окружающей атмосферы при кинетических измерениях открытого планшета.

 

 

Известно, что характерное приращение оптической плотности инокулиро-ванной питательной среды свидетельствует о размножении в ней микроорганизмов. Высокий уровень корреляции оптической плотности с количеством микробных тел позволяет опосредованно "кривую роста оптической плотности" называть "кривой микробного роста". Для получения кривых микробного роста необходимо провести динамическое измерение оптической плотности в лунках планшета через равные промежутки времени при определенных длинах волн фотомет-рирования. При проведении динамических измерений на экране монитора высвечивается время вступления микроорганизмов биосубстрата в стадию экспоненциального роста. Установлено, что этот показатель тесно коррелирует с исходным количеством микроорганизмов практически в любом биосубстрате; при исходной обсемененности 108–109 микрооганизмов в 1 мл время вступления в фазу экспоненциального роста равняется 15–30 мин. Методика позволяет в течение первых 5 ч выявить пробы с исходной обсемененностью более 105 КОЕ/мл. Для этого на протяжении указанного периода времени, не прерывая динамического измерения, программа выдает на экран монитора номера лунок планшета, в которых микроорганизмы вступили в фазу экспоненциального роста, что свидетельствует о высокой обсемененности проб биоматериалов. Необходимо сделать высев этих проб на плотные питательные среды для получения чистой культуры, с тем чтобы уже на следующие сутки была возможность провести идентификацию выделенных культур и определить их антибиотикочувствительность.

 

По окончании проведения динамического измерения оптической плотности в лунках планшета (через 15–20 ч) программа "БАКТ" позволяет получить полные кривые роста микроорганизмов, присутствующих в биоматериале, в разведениях биоматериала 1:10, 1:100 и 1:1000 (рис. 17.7).

Для проведения исследования моча, раневое отделяемое и другие биосубстраты разводятся микротитрованием непосредственно в стандартном стерильном 96-луночном планшете в питательном бульоне; в одном планшете одновременно можно определить степень обсемененности 31 пробы различных биосубстратов. Специальный алгоритм математической обработки кинетических моделей роста микроорганизмов позволяет определять степень обсемененности мочи, раневого отделяемого и других биологических жидкостей. Через 15–20 ч инкубирования программа рассчитывает точное количество микроорганизмов в пересчете на 1 мл/г/см2 биосубстрата.

Данный метод позволяет обследовать одновременно большое количество больных при низких материальных и трудовых затратах по сравнению с традиционными количественными и полуколичественными методами. Получаемое при этом точное количество микроорганизмов может служить тестом при проведении мониторинга эффективности назначенной антибактериальной терапии.