2020-05-21
208
Оттитрованные ингредиенты (АГ, комплемент, гемолитическая сыворотка) разводят физ.раствором. При постановке реакции вначале смешивают исследуемую сыворотку, антиген и комплемент. Смесь выдерживают в термостате при 37°С в течение 20-30 минут. По истечении указанного срока в пробирки добавляют сенсибилизированную гемолитическую систему. пробирки встряхивают, помещают в термостат при 37°С на 20-30 минут, а затем оценивают результат.
Схема основного опыта РСК
| Ингредиенты в мл. | 1 | 2 (КА) | 3 (КС) |
| Испытуемая сыворотка в разведении 1:5 | |||
| Антиген | |||
| Комплемент | |||
| Физ. раствор | |||
| Пробирки инкубируют при 37°С в течение 20 – 30 минут | |||
| Гемолитическая сыворотка | |||
| Взвесь эритроцитов | |||
| Пробирки инкубируют при 37°С в течение 20 – 30 минут | |||
| Учет и оценка результата | |||
Учет и оценка результатов РСК.
В зависимости от степени выраженности гемолиза РСК оценивается по 4-плюсовой системе следующим образом:
“++++” резко положительная реакция – полная задержка гемолиза: эритроциты оседают на дно пробирки, жидкость над осадком бесцветна;
“+++” и “++” положительная реакция – полная задержка гемолиза: имеется осадок эритроцитов, жидкость окрашена в розовый цвет, более интенсивны й при ++;
“+” сомнительная реакция – неполный гемолиз: незначительный осадок эритроцитов, жидкость окрашена в розовый цвет;
“-” отрицательная реакция – полный гемолиз: жидкость ярко-розового цвета.
Вывод:
Современные иммунодиагностические реакции
Реакции иммунофлюоресценции (РИФ), иммунолюминесцентный метод (ИЛМ,) метод флуоресцирующих антител (МФА) (англ.Immunofluorescence) - лабораторный иммунологический метод качественного определения антигена по известному глобулину или антител по известному антигену.
Сущность метода флюоресцирующих антител заключается в визуализации реакции антиген-антитело люминесцентными маркерами.
Различают РИФ прямой, РИФ непрямой инепрямой РИФс комплементом.
При прямом методе (пРИФ) на препарат с антигеном наносят известную, предположительно соответствующую ему, люминесцирующую сыворотку. В случае образования комплекса, он обнаруживается, люминесцентной микроскопией в виде зеленоватого свечения разной степени интенсивности и четкости.
При непрямом методе (нРИФ) на мазок из наслоения антигена и немеченой сыворотки наносят антиглобулиновую (видовую по отношению к диагностической сыворотке) люминесцирующую сыворотку. В случае образования комплекса антиген-антитело, последний компонент реагирует с видовой антиглобулиновой люминесцирующей сывороткой. При нРИФ с комплементом, его добавляют к комплексу антиген-антитело и идентифицируют образование тройного комплекса по люминесцирующей антикомплементарной сыворотке.
Результаты описываются в так называемых «крестах» (от одного + до четырех ++++) — субъективная градация исследователем степени выраженности реакции. Непрямые методы требуют наличия только антиглобулиновых видовых сывороток с флюорохромами, но при этом необходимо большое количество тестовых контролей. При постановке прямым методом делается только один контроль, но требуется множество моноспецифических сывороток. Недостатками всех видов РИФ является ограниченная чувствительность из-за наличия возможных перекрестных реакций между близкими по антигенному составу объектами и неспецифическая флуоресценция вследствие адсорбции флуоресцирующих глобулинов на различных элементах препарата. В настоящее время используются коммерческие стандартные конъюгаты, содержащие глобулины к исследуемым антигенам.
Задание №2. Опираясь на материал, изложенный выше, нарисуйте схему реакции иммунофлюоресценции (прямой и непрямой).
Иммуноферментный анализ (ИФА, (англ.enzyme-linkedimmunosorbentassay, ELISA) — выявление антигенов с помощью соответствующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой (пероксидазой хрена, бета-галактозидазой или щелочной фосфатазой). После соединения антигена с меченной ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат/хромоген. Субстрат расщепляется ферментом и изменяется цвет продукта реакции — интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител.
Метод ИФА состоит из трех стадий:
1. На поверхности лунки планшета, сорбирован белок - антиген инфекционного агента или антитело к нему. В лунку вносится исследуемый биологический материал, чаще всего сыворотка крови больного. Если в ней содержатся антитела к данному инфекционному агенту или антигены (сами инфекционные агенты), то они образуют иммунные комплексы “антиген-антитело” и остаются связанными при последующей промывке. На этом первая стадия заканчивается. Это основная — “специфическая” стадия процесса. Последующие стадии нужны лишь для выявления образовавшегося иммунного комплекса.
2. На второй стадии анализа в лунку вносят комплекс, состоящий из антитела и фермента (т.н. конъюгат), способный связываться с образовавшимися иммунными комплексами. Если в ячейке имеются образовавшиеся на первой стадии процесса иммунные комплексы, то конъюгат с ними связывается.
3. На следующей стадии в лунку добавляется раствор бесцветного вещества — хромогена. Это вещество приобретает окраску после расщепления его присутствующим в ячейке ферментом. То есть, если все элементы цепочки присутствуют, в лунке образуется окрашенный комплекс. Произошедшая цветовая реакция полностью пропорциональна предшествующей иммунологической, что позволяет выявить и количественно измерить в исследуемом биологическом материале искомый антиген или антитело.
