L. greyi, L. murryi

Таблица 47 - Дифференцирующие признаки видов рода Listeria

Признаки	L. grayi	L. innocua	L. ivanovii	L. monocytogenes	L. murrayi	L. seeligeri	L. wells-himeri
Гемолизин	-	-	+1)	+ 2)	-	+	-
САМР-тест (S. aures)	-	-	-	+	-	+	-
САМР-тест (R. equi)	-	-	+	-	-	-	-
Образование кислоты из маннита	+	-	-	-	+	-	-
L-метил-маннозида		+	-	+		-	+
L-рамнозы	-		-	+	d	-	D
D-ксилозы	-	-	+	-	-	+	+
Гидролиз гиппурата	-	+	+	+	-
Восстановление нитрата	-	-	-	-	+
Патогенность для мышей	-	-	+	+	-	-	-

Примечание к таблице 47

Пробел означает, что признак не исследован. Вид L. denitrificans перенесен в отдельный род Yonesia. ¹⁾ Обычно широкая зона или многочисленные зоны. ²⁾ Некоторые штаммы отрицательные. Обозначения: «d» — 11-80% штаммов положительные.

Далее на газон с культурой бактериологической петлей наносят раз­дельно по одной капле бактериофагов и каплю стерильного бульона (контроль), отмечая карандашом зону каждого фага и контроля. Рас­стояние между каплями должно быть не менее 1 см. Посевы инкубиру­ют при 22-23° С в течение 16-24 часов. В положительном случае на месте нанесения фага образуется прозрачная зона лизиса. Допускается наличие единичных колоний или сплошного нежного роста (вторичная культура) при интенсивном росте культуры на остальной площади пи­тательной среды. Для достоверности результатов целесообразно про­водить 2-3 параллельных исследования. Нелизируемые культуры иден­тифицируют по общим критериям.

Для обнаружения L. monocytogenes также рекомендуется реакция на­растания титра фага (РНФ).

Серологическая идентификация листерий. Идентификация листерий в РА. Листерий имеют О- и Н-антигены, ко­торые могут встречаться в различных комбинациях. Известно не менее 16 сероваров L. monocytogenes, но большая часть случаев заболеваний связа­на с сероварами 48, 1/2а, 1/2в. Антигенная структура листерий представлена в таблице.

Распределение серотипов по видам рода Listeria следующее: L.monocytogenes — 1/2А, 1/2В, 1/2С, 3А, 3В, 3С, 4А, 4АВ, 4С, 4D, 4F, «7»; L. ivanovii -5; L. innocua -4AB, 6А, 6В; L. weishimeri -6A, 6B;
L. seeligeri -l/2B, 4С, 4D, 6В. Как видно, L. monocytogenes имеет одну или несколько антигенных детерминант, общих с другими видами листерий. В РФ диагностические лаборатории используют листериозные агглюти­нирующие сыворотки. Поливалентная сыворотка содержит антитела против антигенов Н — АВ и О — II, V, VI, VII, IX и агглютинирует все известные серовары листерий. Типовые сыворотки позволяют иденти­фицировать листерий 1-го серотипа, которые содержат антигены О — II, и 2-го серотипа, имеющего О-антигены V и VI. Серологическую идентификацию проводят в РА на стекле.

Идентифицируемую культуру выращивают на МПБ при 37° С в тече­ние 24 часов, затем засевают на две пробирки скошенного МПА, выращи­вают при 18-20° С в течение 24-30 часов, смывают стерильным физиоло­гическим раствором и устанавливают концентрацию приблизительно 10-15 млрд микробных клеток в 1 мл.

На первом этапе приготовленный антиген исследуют в РА на стекле с поливалентной сывороткой, смешивая каплю сыворотки и каплю антиге­на, сыворотки и физиологического раствора (контроль). Учет проводят в течение трех минут. При наличии спонтанной агглютинации антигена в контроле опыт повторяют с применением в качестве антигена 24-часовой бульонной культуры, выращенной при комнатной температуре. Для даль­нейшего исследования берут культуры, давшие положительную РА, идентифицированные как листерии.

Таблица 48 - Антигенная структура L. monocytogenes,

На втором этапе определяют серогруппу (серотип) культуры при помощи серогрупповых (типовых) сывороток 1-го и 2-го серотипов (серогрупп). Исследование проводят, как описано выше. По данным отечественных ав­торов абсолютное большинство изолированных штаммов листерии отно­сятся к серотипу 1.

Идентификация листерии методом флуоресцирующих антител (МФА). Метод может быть использован как для обнаружения листерии в исследуемом материале, так и для идентификации выделенных куль­тур. Используют флуоресцирующие сыворотки против сероваров 1,4а, 4b. Применяют, в зависимости от наличия флуоресцирующих сыворо­ток, прямой и непрямой методы МФА. Из паренхи­матозных органов готовят суспензию на физиологическом растворе 1:5, после осаждения крупных частиц из нее готовят мазки. Мазки из голов­ного мозга, помимо фиксации спиртом, дополнительно обрабатывают ацетоном (2-3 раза по 5 минут) для удаления жировых компонентов, дающих неспецифическое свечение. Культуры листерии исследуют в 18-24-часовом возрасте.

Идентификация листерии также может быть проведена непрямым иммунопероксидазным методом. Антитела из диагностических сывороток в этом случае метят пероксидазой. Мазки готовят из головного мозга, паренхи­матозных органов, фиксируют в химически чистом ацетоне, в качестве суб­страта используют 0,05%-ный раствор 3,3-диаминобензидина тетрагидрохлорида (ДАВ).

Имеются сообщения об успешном использовании в диагностике листериоза ПЦР.

Биопроба. Заражение лабораторных животных применяют для обнаружения пато­генных листерии в исследуемом материале, а также с целью определения патогенных свойств выделенных культур. Для обнаружения листерии в материале из паренхиматозных органов или головного мозга готовят сус­пензию и в дозе 0,3-0,5 мл вводят белым мышам массой 14-16 г (2-3 головы) подкожно или внутрибрюшинно. Внутримышечная инъекция кортизона (5 мг) повышает чувствительность животных. Наблюдение ве­дут в течение 10 суток. При положительных результатах гибель обычно наступает на 2-6 сутки, в большинстве случаев в паренхиматозных орга­нах находят некротические очажки. Павших животных подвергают пол­ному бактериологическому исследованию. С целью определения патогенных свойств выделенных культур также используют белых мышей, кроликов, морских свинок, куриные эмбрионы.

При титрации на мышах LД₅₀ вирулентных штаммов листерии колеб­лется в пределах 10-1000 м.к. Заражение в желточный мешок 10-дневных куриных эмбрионов куль­туры в дозе 10 м.к. приводит к их гибели в течение 2-5 дней. Биопроба на кроликах с параллельным контролем количества моно­цитов позволяет дать оценку специфичности результата опыта. Количество моноцитов в положительных случаях увеличивается в несколько раз. Кро­ликов заражают внутривенно в дозе 0,5-1 млрд м.к. Срок наблюдения — 14 суток. Для дифференциации патогенных культур листерии от возбудите­ля рожи также проводят копъюктивальную пробу на морских свинках или кроликах (Anton's-тест). На конъюктиву глаза морской свинки или кроли­ка наносят две капли бульонной культуры. В положительном случае через 24-96 часов развивается гнойный конъюктивит, Е. rhusiopathiae такую патологию не вызывает.

Серологическая диагностика. Исследуют животных, подозреваемых в заболевании листериозом, а также животных из групп, где диагноз на листериоз уже установлен. Применяют пробирочную РА, РНГА и РСК. Серологи­ческие исследования дополняют другие методы диагностики листериоза и позволяют обнаружить переболевших, скрытых больных, бактерионосите­лей. Особенностью отечественной серологической диагностики является то, что серовары с 1/2а по 3с, используемые в международной классифика­ции, объединены в первую серогруппу, а остальные — во вторую.

В РА используют антигены 1-го и 2-го сероваров в соответствии с наставлением по их применению. В качестве контрольных применяют соответствующие позитивные (1-й и 2-й серовар) сыворотки. Сыворотки исследуют параллельно с двумя указанными антигенами. РА ставят в объеме 1 мл с сыворотками крови крупного рогатого скота в разведени­ях 1:160-1:320; коз, овец, свиней — 1:80-1:160; кроликов — 1:20-1:40. РА с контрольной позитивной сывороткой ставят в разведениях до ее предельного титра, с контрольной негативной — в тех же разведени­ях, что и с исследуемыми сыворотками. Кроме того, ставят контроль каждого антигена с физиологическим раствором. Пробирки выдержи­вают при 37° С в течение 18-20 часов, затем 2 часа при комнатной температуре и учитывают результат. За положительный результат при­нимают положительные показания РА у крупного рогатого скота и лошадей в титре 1:320; овец, свиней, коз — 1:160; кроликов — 1:40. Отри­цательные сыворотки рекомендуется исследовать дополнительно после обработки 2-меркаптоэтанолом (2-МЭ) или солянокислым цистенном. После такой обработки ставят РА по вышеизложенной схеме и за поло­жительный результат у крупного рогатого скота и лошадей принимают титры 1:40; овец, коз и свиней — 1:20; кроликов — 1:10.

Обработка сывороток 2-МЭ. 2-меркаптоэтанол разводят до титра в соответствии с указанием на этикетке. Сыворотки крови разводят физио­логическим раствором: крупного рогатого скота и лошадей — 1:20; овец, коз, свиней — 1:10; кроликов — 1:5. К 1 см разведенной сыворотки добав­ляют 1-2 капли раствора 2-МЭ, пробирки закрывают резиновыми проб­ками и выдерживают 60 минут в водяной бане при 37° С. После этого иссле­дуют в РА сыворотки крови крупного рогатого скота и лошадей в разведе­нии 1:40; овец, коз, свиней — 1:20; кроликов — 1:10. Обработка сыворо­ток солянокислым цистеином. Растворяют 35,1 мг цистеина в 1 мл 0,2 М NaOH. Сыворотки крови крупного рогатого скота и лошадей разводят физиологическим раствором 1:10; овец, коз, свиней — 1:5; кроликов — 1:2,5. К 0,5 мл цистеина, пробирки закрывают резиновыми пробками и вы­держивают при 37° С в течение 18-20 часов. Затем исследуют сыворотки крупного рогатого скота и лошадей в разведении 1:40; овец, коз, свиней — 1:20; кроликов — 1:10. Для исследования сывороток крови в РСК исполь­зуют листериозный антиген для РСК, реакцию ставят в объеме 1 мл. Для контроля используют позитивные листериозные сыворотки и негативные исследуемого вида животного. Комплемент в бактериологической системе титруют в присутствии инактивированных сывороток (1:10) того вида жи­вотных, который исследуют. Режим инактивации сывороток:
30 минут при 56-57° С сыворотки крупного рогатого скота и свиней, лошадей и овец — при 58-59° С, кроликов при — 60° С. Реакцию считают положительной при задержке гемолиза на 3-4 креста, сомнительной — на 2 креста. Сыво­ротки крови от сомнительно реагирующих животных исследуют повторно через 2-3 недели.

Реакция связывания комплемента. Используют листериозный анти­ген ВНИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии для исследова­ния сыворотки крови всех видов животных. РСК ставят в объеме 2,5 мл по стереотипной схеме с сыворотками, разведенными 1:10. Для контро­ля применяют нормальные сыворотки крови от заведомо здоровых жи­вотных и позитивные от переболевших листериозом животных. Первую фазу РСК проводят при 37-38° С в течение 20 минут, вторую также при 37-38° С 20 минут. Учет результатов проводят сразу после изъятия про­бирок из водяной бани и окончательно через 14-18 часов выдержива­ния проб при комнатной температуре. За положительный результат при­нимают задержку гемолиза на три-четыре креста, сомнительный — за­держку гемолиза на один-два креста. Сыворотки крови животных, дав­ших сомнительную РСК, исследуют повторно через 2-3 недели и при получении задержки гемолиза не менее чем на два креста результат оце­нивается положительно.

При постановке РНГА используют диагностикум Омского НИИ природноочаговых болезней.

Питательные среды. Оптимальными питательными средами для выделения листерий считаются МПА или печеночный агар и МПБ с 1% глюкозы и 2-3% глицерина (рН 7,2-7,4), а также кровяной агар. В случае необходимости для первичного выделения листерий используют питательные среды, содержащие вещества, ингибирующие рост сопутствующей микрофлоры.

Среда с теллуритом калия. В 1000 мл расплавленного МПА (рН 7,2) добавляют 10 мл 2%-ного водно-глицеринового раствора теллурита калия и 50-100 мл стерильной сыворотки крови крупного рогатого скота. Ком­поненты перемешивают и среду сливают в чашки Петри. Питательная сре­да обладает элективными свойствами по отношению к L. monocytogenes.

Среда с теллуритом калия, полимиксином, флоримицином. В 1000 мл расплавленного МПА (рН 7,2-7,4) добавляют 10 см 2%-ного водно-гли­церинового раствора теллурита калия, 0,3-0,5 мл раствора флоримицина или полимиксина (500 тыс. ЕД препарата разводят в 10 мл физиологическо­го раствора). Листерий восстанавливают теллурит калия до металличес­кого теллура, благодаря чему их колонии приобретают черный цвет. При исследовании растительных субстратов рекомендуется использовать МПА с 0,0035% трипафлавина и 0,001% налидиксовой кислоты, а также МПБ с 3,75% калия родонистого и МПБ с 10% натрия хлорида.

Среда с ацетатом калия и налидиксовой кислотой. Питательный бульон (Оксоид), содержащий: глюкоза — 0,2%; таллия аце­тат — 0,2%; налидиксовая кислота — 40 мкг/мл. Кристаллическую налидиксовую кислоту (0,05 г) растворяют в 0,5 мл 1N NaOH, после растворе­ния добавляют 4,5 мл дистиллированной воды, после чего вносят до необ­ходимой концентрации в среду. Стерилизуют при 121° С в течение 15 ми­нут.

Бульон для листерий с KCNS. Пептон — 20 г; глюкоза (декстроза) — 2 г, NaCl — 5 г, Na₂HP0₄ — 2,5 г, дистиллированная вода — 1000 мл, рН — 7,3. Среду стерилизуют при 121° С в течение 15 минут. До стерилизации в среду добавляют 3,74% тиоционата калия.

Среда с тиоцианатом калия и налидиксовой кислотой. Питательный бульон (Оксоид), содержащий калия тиоцианата 3,75%, налидиксовой кислоты — 100 мкг/мл. Среду стерилизуют при 121° С в те­чение 15 минут. Налидиксовую кислоту добавляют в виде раствора к сте­рилизованной среде.

Трипафлавин-налидиксовый агар. Триптозный агар (Дифко) —
41 г; налидиксовая кислота — 0,04 г; дистиллиро­ванная вода — 1000 мл. Кристаллическую налидиксовую кислоту (0,8 г) растворяют в 10 мл 1N NaOH и объем доводят до 100 мл дистиллирован­ной водой; 5 мл раствора налидиксовой кислоты добавляют к среде до кон­центрации 40 мкг/мл. Стерилизуют после этого этапа среду при 120° С в течение 15 минут, охлаждают до 70° С и добавляют раствор трипафлавина до конечной концентрации 10 мкг/мл. Раствор трипафлавина (0,5%-ный, водный) готовят предварительно.

Обогатительный бульон. Питательная основа — триптиказо-соевый бу­льон с дрожжевым экстрактом, селективными факторами являются соля­нокислый акрифлавин — 0,02-0,01 г/л, налидиксовая кислота — 0,05 - 0,01 г/л, циклогексимид — 0,05-0,01 г/л.

Оксфорд-агар. К питательной основе добавляют (г/л) эскулин — 1,0, цитрат железистого аммония — 0,5, хлорид лития — 15,0, циклогексимид — 0,4, колистин — 0,02, акрифлавин — 0,005, цефотстан — 0,002, фосфомицин — 0,01.

PALCAM-arap. В питательный агар вносят (г/л) эскулин — 0,8; цитрат железистого аммония — 0,5; хлорид лития — 15,0; акрифлавин — 0,005; полимиксин В — 0,01; цефтазидим — 0,02; фенилрот — 0,08.

Агар Мак-Брайда для листерий. Пептон — 10 г; мясной экстракт —
3 г; NaCl — 5 г; ангидрид глицина — 10 г; LiCl — 0,5 г; фенилэтанол — 2,5 г; агар — 15 г; дистиллированная вода — 1000 мл; рН — 7,3. Среду стерилизуют 15 минут при 121° С. К охлажденной до 45-50° С среде добавляют 5% крови барана.

Индикаторные среды для идентификации листерий. Посевы инкубируют при 37-38° С, результаты учитывают через 3, 6, 24 и 48 часов.

Среда с лакмусом. В 100 мл бульона Хоттингера или МПБ (рН 7,3-7,5) добавляют 1 мл настойки лакмуса, стерилизуют при 110° С 30 минут. Возбудитель листериоза обесцвечивает среду через 3-6 часов. При учете результатов пробирки не встряхивать.

Среда с метиловым красным. В 100 мл бульона Хоттингера или МПБ добавляют 0,3 см стерильного 0,1%-ного водного раствора метилрота. Цвет среды лимонно-желтый. В положительных случаях среда обесцвечивается через 3-6 часов. Восстановление исходного цвета среды не отмечается.

Среда с конгротом. В 100 мл бульона Хоттингера или МПБ вносят 0,3 мл стерильного 0,1%-ного водного раствора конгрота. Цвет среды красный. Возбудитель листериоза обесцвечивает среду через 6-48 часов. Восста­новления цвета среды нет.

Среда с амидочерным. В 100 мл бульона Хоттингера или МПБ добавляют 0,3 мл стерильного 0,1%-ного водного раствора амидочерного. Цвет среды черный с фиолетовым оттенком. В положительных случаях обесцвечивание среды отмечается через 6-48 часов. Восстановления цвета среды нет.

Среда с нейтральротом иметиленовым синим. В 100 мл бульона Хоттин­гера или МПБ вносят по 1 мл 0,1%-ных водных стерильных растворов нейт ральрота и метиленовой сини. Цвет среды зеленый или зеленовато-голубова­тый. При учете результатов (через 3-6 часов) пробирки не встряхивать.