Работа № 6. Определение активности холинэстеразы в головном мозге

В ткани мозга содержатся специфическая и неспецифическая холинэстеразы. Специфическая – гидролизует ацетилхолин, неспецифическая – помимо ацетилхолина гидролизует бутирил- и бензоилхолины.

Взвесить на торсионных весах 100 – 200 мг ткани серого вещества больших полушарий или коры мозжечка (ферментативная активность сохраняется на холоду в течение 1 – 2 недель). Навеску ткани растереть в ступке в 50-кратном количестве дистиллированной воды до образования равномерно опалесцирующей взвеси. Осадок из раствора перенести в 2 пробирки и добавить по 3 мл дистиллированной воды. В первую - контрольную – добавить 1 мл индикаторно-буферного раствора № 1 (200 мг бромтимолового синего растереть в ступке с 20 мл 0,1 н раствора NaOH). Контрольный раствор перенести в мерную колбу на 1 л, добавить 50 мл 0,1 М раствора борной кислоты в 0,1 М растворе KCl. Содержимое колбы довести до метки свежей дистиллированной водой. Раствор имеет насыщенный синий цвет и рН 8,4, стоек при хранении. Во вторую – опытную - пробирку добавить 1 мл индикаторно-буферного раствлора №2 (к 1,8 мл индикаторно-буферного раствора №1 добавить 0,2 мл 1% раствора ацетилхолина или 0,2 мл 1,57% раствора бутирилхолинйодида, или 1,1% раствора бутирилхолинхлорида. Готовить раствор следует не раньше, чем за 3 часа до опыта).

Обе пробирки поставить в термостат при температуре 38ºС на 15 мин, при необходимости – дольше. В результате ферментативного расщепления субстрата наблюдается постепенное освобождение уксусной/масляной кислоты и изменение окраски индикатора от синего или сине-зеленого в опытной пробирке к желтой.

Эталоны ответов на тесты контроля исходного уровня знаний

Вид 1. А) 2; Б) 4.

Вид 2. А) 1А, В, Д; 2Б, Г. Б) 1В, Г; 2А, Б, Д, Е, Ж, З; 3Б, 4Б, 5Д, 6Д, 7Е, З.

Вид 3. А)5, 4, 7, 2, 6, 1; Б) 4, 3, 8, 7, 2, 5, 1, 6, 4.

Вид 4. А) А (+, +, +); Б) А (+, +, +).

Эталоны ответов на ситуационные задачи

Задача 1. Будет нарушен обмен, в первую очередь, γ-аминомасляной кислоты (ГАМК), поскольку глутаминовая кислота, из которой она образуется, будет использоваться по преимуществу на связывание аммиака с образованием глутамина.

Задача 2. В первом случае блокируется субстратное фосфорилирование (в гликолизе) и окислительное фосфорилирование (в цепи переноса электронов), в результате чего нарушается синтез АТФ, необходимый для акта мышечного сокращения. Во втором случае в миоците сохраняется возможность синтеза АТФ путем субстратного фосфорилирования (при гликолизе), поэтому мышца реагирует на электростимуляцию.