Определение уровня свободного и этерифицированного холестерина в сыворотке крови прямым методом, основанном на реакции Либермана - Бурхарда

Принцип метода. Свободный холестерин осаждают дигитонином

и устанавливают в осадке по реакции Либермана-Бурхарда.

Реактивы

1. Реактив для определения содержания холестерина. 5,55 г 2,5-диметилбензолсульфокислоты растворяют в 100 мл ледяной уксусной кислоты. Смешивают 3 объёма уксусного ангидрида, 1 объём раствора 2,5-диметилбензолсульфокислоты и 1 объём ледяной уксусной кислоты.

2. Уксусная кислота, концентрированная.

3. Раствор дигитонина в изопропиловом спирте.

4. Изопропиловый спирт.

5. Серная кислота, концентрированная.

6. Стандартный раствор холестерин-дигитонина. 200 мг холестерина и 888 мг дигитонина растворяют в 80 мл уксусной кислоты в мерной колбе на 100 мл при нагревании её на водяной бане. После охлаждения раствора его объём доводят до метки ледяной уксусной кислотой.

7. Стандартный раствор для определения общего холестерина. 200 мг холестерина растворяют в 100 мл ледяной уксусной кислоты.

Ход определения концентрации общего холестерина. Готовят опытную пробу. К 0,05 мл сыворотки добавляют 2,5 мл реактива 1, пробирку помещают в водяную баню и выдерживают при температуре 25˚С в течение 5-10 мин.Затем в пробу доливают 0,5 мл концентрированной серной кислоты и вновь ставят в водяную баню на 10 мин. Оптическую плотность пробы измеряют на ФЭКе в кювете толщиной слоя 5 мм (длина волны 560-590 нм). Результаты сравнивают с данными контрольной пробы. Её ставят, как опытную,но вместо сыворотки берут 0,05 мл дистиллированной воды. Стандартную пробу обрабатывают, как опытную, но вместо сыворотки используют 0,05 мл стандартного раствора для установления уровня общего холестерина.

Ход определения содержания свободного холестерина. К 0,05 мл сыворотки добавляют 1 мл раствора дигитонина, смесь оставляют на 10 мин, затем центрифугируют 10 мин (при 1500-3000 об/мин). Надосадочную жидкость тщательно отсасывают и выливают. К осадку приливают 3 мл реактива 1, содержимое пробирки перемешивают и центрифугируют. К 2,5 мл надосадочной жидкости приливают 0,5 мл концентрированной серной кислоты, раствор помещают в водяную баню при 25˚С на 10 мин, после чего измеряют его абсорбцию в области длин волн 560-590 нм на ФЭКе в кювете с толщиной слоя 5 мм. Результаты сравнивают с аналогичными данными контрольной пробы.

Для приготовления контрольной пробы к 0,05 мл сыворотки

добавляют 1,0 мл изопропилового спирта, смесь оставляют на 10 мин,

затем центрифугируют в течение 10 мин при 3000 об/мин. Надосадочную

жидкость сливают, а осадок обрабатывают также, как и опытную пробу.

Для получения стандартной пробы к 0,05 мл дигитонин-холестеролового стандартного раствора приливают 3,0 мл реактива 1 и содержимое пробирки перемешивают. К 2,5 мл смеси добавляют 0,5 мл концентрированной серной кислоты и пробу обрабатывают, как опытную.