Полимеразная цепная реакция

Принцип ПЦР был описан в 1986 г. Сущность ПЦР заключается в амплификации, или образовании множественных копий, интересующих участков ДНК/РНК, как правило размером до 5000 п.о. (увеличение размера приводит к снижению эффективности реакции). В качестве амплифицируемых участков ДНК могут выступать гены патогенности, жизненно-важных функций, устойчивости к противомикробным препаратам, видо- и родоспецифические гены (для идентификации нередко используют 16S рРНК гены), гены с неустановленными функциями.

Объектом исследования с использованием молекулярно-биологических методов выступает ДНК/РНК, поэтому на первой стадией ПЦР всегда осуществляется выделение ДНК/РНК из клеток, параллельно на этом этапе удаляются и клеточные ингибиторы ПЦР. В дальнейшем на выделенной ДНК-матрице происходит синтез множественных копий, поэтому важным условием проведения ПЦР является присутствие строительного материала ДНК – дНТФ — нуклеотидов и фермента, осуществляющего их полимеризацию – Taq-полимеразы, уникальность которого связана с отсутствием денатурации при нагревании до 96 °С, так как выделяют его из термофильных микроорганизмов Termophilus aquaticus, обитающих в гейзерах. Как и любой другой фермент, Taq требует определенных условий – рН, концентрации солей, что достигается внесением в реакционную смесь буфера для Taq и MgCl₂. В связи с тем, что проводят амплификацию не всей бактериальной ДНК, а лишь фрагмент до 5000 п.о., то специфический участок ДНК ограничивают с двух сторон праймерами (прямым и обратным) – цепочками нуклеотидов (до 15-30 оснований), связывающихся с комплементарными структурами исследуемой ДНК. Используемые в ПЦР праймеры должны соответствовать ряду требований: 1) содержание цитозина (С) и гуанина (G) не должно превышать 40-60%; 2) С и G должны распределяться равномерно по всей длине праймера; 3) температура плавления праймеров не должна отличаться более 5°C; 4) во избежание неспецифического связывания и образования димеров, используемые в реакции праймеры на 3'-конце не должно иметь более трех остатков G/C и не должны быть комплементарны друг другу.