2015-05-26
1947
| Реактив | Комментарии[2] |
| 1. Праймеры прямой и обратный | Концентрация каждого вносимого праймера должна составлять 10 – 25 пкмоль/реакцию |
| 2. Буфер для Taq | Вносят в однократной концентрации |
| 3. Смесь дНТФ | Концентрация смеси каждого дНТФ в реакции должна составлять 200 мкМ |
| 4. MgCl2 | Концентрация может варьировать в пределах 1-4 мМ/реакцию, предпочтительно использовать 1,5 ±0,25мМ |
| 5. Taq-полимераза | Вносят в количестве 1 или 1,25 ед/реакцию |
| 6. ДНК микроорганизма | Вносят в количестве 5 – 15 мкл |
| 7. Вода безнуклеазная | Доводят объем реакции до 25 или 50 мкл |
Полимеразная цепная реакция происходит в несколько этапов: 1) денатурация - образование из двуцепочечной ДНК одноцепочечной молекулы; 2) отжиг - ограничение амплифицируемого фрагмента путем присоединения прямого и обратного праймеров; 3) элонгация - полимерезации дочерних цепочек на ДНК-матрице. Каждая из этих стадий протекает при определенной температуре. Реакцию амплификации повторяют 20-45 раз, предваряя ее дополнительной денатурацией и заканчивая дополнительной элонгацией.
|
|
|
Температурно-временные режимы ПЦР:
1. Первоначальная денатурация. Выполняется 1-3 минуты при 95°C. На этой стадии из дуплексов исходной геномной ДНК образуются одноцепочечные молекулы ДНК.
2. ПЦР-цикл. Количество циклов зависит от количества исходного материала ДНК. Если количество исходных ДНК-копий менее 10, необходимо проводить 40 – 45 циклов, если более – 25 - 35 циклов.
а) стадия денатурации. Осуществляется при 94 - 95°C в течение 0,5-2 минут. На этой стадии из дуплексов амплифицированной ДНК образуются одноцепочечные молекулы. Уменьшение времени реакции по сравнению со стадией первоначальной денатурации обусловлено тем, что синтезируемые в процессе ПЦР продукты короче, чем исходная цельная ДНК.
б) отжиг праймеров. На этой стадии праймеры присоединяются к комплементарным участкам ДНК и ограничивают фрагмент для амплификации. Для отжига достаточно 0,5-2 минут. Температура для этой стадии рассчитывается по формуле:
Tm=4(Г+Ц)+2(A+T) - 5, где
Г, Ц, A, T – количество соответствующих оснований в праймере.
в) стадия элонгации. На этой стадии Taq-полимераза присоединяется к 3¢ концу праймера и синтезирует на ДНК-матрице копию, после чего из одноцепочечных фрагментов ДНК образуются дуплексы. Осуществляется при 70-75°C в течение 1 минуты.
3. Финальная стадия элонгации. После последнего проведенного цикла образцы инкубируются при 72°C в течение 5-15 минут для образования дуплексов.
В результате ПЦР происходит экспоненциальное увеличение копий ДНК (ампликонов), описываемое формулой 2n, где n - число циклов амплификации. Образование огромного количества копий (108) позволяет выявлять их путем электрофореза в агарозном или акриламидном геле с последующей окраской ДНК-красителем - этидием-бромидом, флюоресцирующим в УФ-свете (290 нм) трансиллюминатора. В процесс электрофореза фрагменты ДНК передвигаются в зависимости от молекулярной массы и полярности и образует видимую в УФ-свете полосу.
|
|
|
Достоинства метода: 1) высоко чувствителен (позволяет обнаружить микроорганизмы в материале в концентрации 1 – 10 клеток); 2) высоко специфичен (позволяет идентифицировать большинство существующих микроорганизмов). Недостатки: требует дорогостоящего оборудования.
