Некоторые методы выделения чистых культур бактерий

Культуральный способ

Этот способ используется для выделения бактерий рода Proteus, которые растут, как правило, на обычных питательных средах сплошной пленкой («ползучий рост»). Для выделения чистой культуры протея исследуемый материал засевают по методу Шукевича у основания скошенной части агара в конденсационную воду. Через сутки на всей поверхности скошенной части агара отмечается рост протея, в то время как другие ассоцианты остаются на месте нанесения материала.

Физический способ выделения чистой культуры бактерий

Он используется для выделения споровых бактерий. Для этого смесь бактерий, содержащих споровые микроорганизмы, подвергают кипячению в течение 5 минут для уничтожения неспоровых бактерий. После этого кипяченый материал засевается штрихом в чашки Петри на одну ее половину, а на другую засевается смесью до кипячения.

Химический способ выделения бактерий

Этот метод используется для выделения кислотоустойчивых бактерий. Исследуемый материал обрабатывается 5% серной кислотой, все некислотоустойчивые микробы погибают. После этого материал засевают на питательную среду.

Биологический способ выделения чистой культуры

Этот способ заключается в том, что исследуемым материалом заражают лабораторное животное, чувствительное к какому-то микробу, содержащемуся в этом материале. У животных возникает типичный инфекционный процесс с накоплением соответствующего возбудителя во внутренних органах, из которых легко выделяется чистая культура.

Занятие №5

Питание, дыхание и размножение микроорганизмов

Бактериологический метод диагностики (продолжение)

Вопросы для подготовки

1. Конструктивный метаболизм: биосинтез углеводов и аминокислот у прокариот. Энергетические затраты клетки.

2. Общая характеристика энергетических процессов у прокариот – брожение (классификация, продукты) и дыхание. Выход АТФ.

3. Классификация микроорганизмов по типу дыхания (строгие аэробы, факультативные анаэробы, строгие анаэробы, микроаэрофилы, капнофилы). Дыхательные цепи аэробов, факультативных анаэробов и облигатных анаэробов. Сущность анаэробиоза.

4. Методы культивирования анаэробов. Питательные среды.

5. Ферменты бактерий. Конститутивные и индуцибельные ферменты, их роль в сохранении вида. Понятие «хемовар».

6. Бактериологический метод диагностики (III и IV этапы/дни исследования). Цель и задачи. Этапы идентификации чистой культуры микроорганизмов:

а) методы изучения протеолитических свойств у бактерий.

б) методы изучения сахаролитических свойств у бактерий: среды Гисса («пестрый ряд»), комбинированные среды типа Ресселя, Олькеницкого.

в) панели биохимической идентификации и система индикаторных бумаг (СИБы), их преимущество.

г) автоматизированные системы идентификации микроорганизмов. Принцип, достоинства и недостатки.

7. Заполнить таблицу «Среды для культивирования разных групп микроорганизмов»:

Группа микроорганизмов	Тип питания	Тип дыхания	Пример питательной среды
Стафилококки
Клостридии
Риккетсии
Хламидии

8. Заполнить таблицу «Схемы дыхательных цепей»:

Аэробы	Факультативные анаэробы	Облигатные анаэробы

Практическая работа

З а д а н и е №1

Изучить методы культивирования анаэробов. Результаты оформить в виде таблицы.

Метод, среда	Условия создания анаэробиоза	Рисунок
Методы
Физический
Химический
Биологический		–
Специальные среды
Китта-Тароцци
Вильсона-Блер
СКС (среда для контроля стерильности)

З а д а н и е №2

В бактериологическую лабораторию поступил исследуемый материал (испражнения) от больного с предварительным диагнозом: «Пищевая токсикоинфекция?» При микроскопии материала обнаружены грамположительные кокки и грамотрицательные палочки. Выделить чистые культуры микроорганизмов, провести их идентификацию. Сделать заключение об этиологии пищевой токсикоинфекции. Оформить протокол бактериологического исследования по дням.

День исследования	Метод и его содержание	Полученные результаты	Вывод
	Цель	1. Приготовление фиксированного препарата – мазка из испражнений. 2. Фиксация жаром. 3. Окраска по Граму. 4. Иммерсионная микроскопия (90×). Посев исследуемого материала на чашку Петри с МПА по Дригальскому	Рисунок	Обнаружены грам+ кокки и грам- палочки
Обнаружение предполагаемого возбудителя в исследуемой культуре и его идентификация по морфологическим и тинкториальным свойствам
	...	...	...	...

М е т о д и ч е с к и е у к а з а н и я

1-й день исследования: Приготовление фиксированного препарата из испражнений, окраска по Граму. Посев исследуемого материала на МПА в чашку Петри по способу Дригальского.

2-й день исследования: Изучение культуральных свойств выросших колоний. Дифференцируют разные типы колоний (см. предыдущее занятие). Проводят расчет показателя микробной обсемененности на 1 г фекалий (ПМО). ПМО (КОЕ/г) = m10ⁿ⁺¹, где m – количество колоний, выросших на чашке, n – величина разведения.

Из материала части колоний готовят мазок, окрашивают по Граму и микроскопируют. Остаток колоний отсевают петлей в пробирку на скошенный МПА для получения чистой культуры. Посевы ставят в термостат при 37°С на 12-18 ч.

3-й день исследования: Проверяют чистоту выделенных культур бактерий по изучению характера роста бактерий на скошенном агаре (см. предыдущее занятие) и микроскопии мазков из этих культур (окраска по Граму). Делают высев чистой культуры с агара на биохимические панели идентификации, среды Гисса и в МПБ с целью изучения сахаролитических и протеолитических свойств бактерий. Посевы ставят в термостат при 37°С на 12-18 ч.

4-й день исследования: Оценивают результаты биохимической активности по изменению цвета в лунках биохимической панели, сред Гисса и СИБ-полосок. На средах Гисса с углеводами отметить наличие кислых продуктов расщепления углеводов и газообразование. На МПБ обратить внимание на характер роста, отметить наличие продуктов гидролиза белков (сероводорода и индола).

По результатам изучения свойств выделенных чистых культур определяют виды микроорганизмов. Используют определитель Берджи.

Выдают окончательный ответ: из испражнений больного выделили _________________.

Справочный материал для оформления протоколов

Дифференциальные признаки некоторых бактерий

Род и вид	Escherichia coli	Staphylococcus aureus	Klebsiella pneumoniae	Pseudomonas aeruginosa
Морфология	палочка	кокк	палочка	палочка
Окраска по Граму	грам-	грам+	грам-	грам-
Рост по Шукевичу	–	–	–	–
Капсула	–	–	+	+/–
Пигмент	–	–	–	+
Лактоза	кг	–	кг	–
Глюкоза	кг	кг	кг	–/+
Сахароза	–	+	кг	–
Манноза	–	кг	–	–
Индол	+/–	–	–	–
H2S	+	–	–	–
Уреаза	–	+	–	–