Классификация питательных сред

При приготовлении питательных сред необходимо учитывать потребность культивируемых микроорганизмов в различных элементах питания. Существует различные классификации питательных сред.

Классификация питательных сред по составу:

1. Простые среды (МПБ, МПА, желатин, пептонная вода). Мясо-пептонный бульон (МПБ) является белковой основой всех сред.

Существует несколько способов приготовления МПБ:

а) на мясной воде с добавлением готового пептона;

б) на переварах продуктов гидролиза исходного сырья при помощи ферментов.

Мясо-пептонный агар (МПА) — получают путем добавления агар-агара (1,5-3%) к МПБ. Если МПА распределен по диагонали пробирки или флакона — это скошенный агар. Если среда распределена в пробирке вертикально высотой 5-7 см, это агар столбиком. МПА, застывший в чашках Петри в виде штастшки — пластинчатый агар. Если среда имеет вертикальный слой высотой 2-3 см, и диагональный слой такой же величины, это полускошенный агар.

2. Сложные среды готовятся на основе простых с определенными добавками (углеводы, кровь, желчь, яйца, сыворотка, молоко, соли, факторы роста и т.п.)

Классификация питательных сред по исходным компонентам:

1. Естественные питательные среды — это натуральный продукт животного или растительного происхождения.

Могут быть:

- Растительные (исходные продукты — соя, горох, картофель, морковь и т.п.).

- Животные (исходные продукты — мясо, рыба, яйца, молоко, животные ткани, желчь, сыворотка крови и т.п.).

- Смешанные (МПА, среда Левенштейна - Йенсена и т.п.).

2. Искусственные среды содержат переработанные естественные продукты (мясную воду, перевар), вещества, полученные из этих продуктов (пептон, дрожжевой и кукурузный экстракты) и различные добавки. Это самая большая и разнообразная по составу наиболее часто применяемая группа сред. Их готовят по определенным рецептам из различных настоев или отваров животного или растительного происхождения с добавлением неорганических солей, углеводов и азотистых веществ.

3. Синтетические среды (известного химического состава) состоят из химически чистых соединений в точно установленных концентрациях (с добавлением углеводов, солей, аминокислот, витаминов и т.п.). На основе этих сред, добавляя к ним естественные или искусственные среды, получают полусинтетические среды.

Классификация питательных сред по консистенции: среды бывают жидкие (среды без агара), полужидкие (с агаром до 1%), плотные (агаровые — 1,5-2,5%). Жидкие среды чаще применяют для изучения физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов, для накопления биомассы и продуктов обмена. Полужидкие среды обычно используют для хранения культур, плотные — для выделения микроорганизмов, изучения морфологии колоний, диагностических целей, количественного учета, определения антагонистических свойств и др.

Классификация питательных сред по целевому назначению: универсальные (общеупотребительные) и специальные.

Универсальные (основные) среды. Эти среды используют для культивирования большинства относительно неприхотливых микроорганизмов или применяют в качестве основы для приготовления специальных сред, добавляя к ним кровь, сахар, молоко, сыворотку и другие ингредиенты, необходимые для размножения того или иного вида микроорганизмов. К этой группе относятся: МПБ — мясо-пептонный бульон, МПА — мясо-пептонный агар, МПЖ — мясо-пептонный желатин и т.п.

Специальные среды. Предназначены для выделения и избирательного культивирования определенных видов микроорганизмов, которые не растут на простых средах.

Различают следующие виды специальных сред: среды обогащения, элективные, дифференциально-диагностические, консервирующие и среды накопления.

Среды обогащения. Многие микроорганизмы не растут на обычных средах, поэтому для повышения питательной ценности среды в нее добавляют углеводы (сахарный бульон или агар) или белки (сывороточный агар и бульон, кровяной агар и бульон). Кровяной агар или кровяной бульон — получают путем добавления к питательной среде 5-10% подогретой стерильной дефибринированной крови барана, кролика, лошади, человека. Среда используется для выделения стрептококков, пневмококков и других бактерий, а также для изучения гемолитической активности. Сывороточный бульон или сывороточный агар получают, путем добавления к простым средам 15-20% лошадиной или бычьей сыворотки.

2. Элективные (избирательные) среды. Эти среды предназначены для избирательного выделения и накопления микроорганизмов определенного вида из материала, содержащего несколько видов микробов. При посеве на них материала, содержащего смесь различных микроорганизмов, раньше всего будет проявляться рост того вида, для которого данная среда будет элективной. Избирательность среды достигается путем создания условий, оптимальных для культивирования определенных микробов (рН, Еh, концентрация солей, состав питательных веществ), т.е. положительной селекцией. Или путем добавления в среду веществ, угнетающих другие микроорганизмы (желчь, высокие концентрации NаС1, антибиотики и др.), т.е. отрицательной селекцией. К этой группе относятся:

Селенитовая среда — является лучшей средой обогащения для сальмонелл и дизентерийных микробов Зонне. Селенит натрия, содержащийся в среде, стимулирует рост этих бактерий и подавляет рост сопутствующей флоры.

Висмут-сульфит агар — содержит соли висмута, бриллиантовую зелень. Сальмонеллы растут на этой среде в виде колоний черного цвета. Другие виды бактерий на этой среде роста не дают.

Желточно-солевой агар (ЖСА) — среда для выделения стафилококков, содержит до 10% хлорида натрия, что подавляет большинство бактерий, содержащихся в материале. Кроме того, эта среда является и дифференциально-диагностической, так как присутствие яичного желтка позволяет выявить фермент лецитиназу (лецитовителлазу), который образуют патогенные стафилококки. Лецитиназа расщепляет лецитин на фосфорхолины и нерастворимые в воде жирные кислоты, поэтому среда вокруг лецитиназоположительных колоний мутнеет и появляется опалесцирующая зона в виде «радужного венчика».

Желчный бульон элективен для сальмонелл, размножение которых стимулирует добавленная 10% желчь, одновременно тормозящая рост сопутствующих микроорганизмов.

Щелочной агар или щелочная пептонная вода элективны для холерных вибрионов, щелочная реакция среды (рН 9,0) не препятствует росту холерных вибрионов, но тормозит рост других микроорганизмов. 3-5 сут. Ж

3. Дифференциально-диагностические среды. Дифференциально-диагностические среды применяют для дифференцировки одного вида микроорганизмов от другого по характеру их ферментативной активности. Состав этих сред подбирают с таким расчетом, чтобы четко выявить наиболее характерные свойства определенного вида микроорганизмов, основываясь на особенностях его обмена веществ.

- Среды для выявления протеолитической и гемолитической способности микробов, содержащие в своем составе белковые вещества: кровь, молоко, желатин и т.п. Наиболее распространенными средами являются мясо-пептонный желатин (МПЖ) свернувшаясялошадиная сыворотка, молоко и кровяной агар (КА).

- Среды для изучения гликолитических свойств включают три основных компонента: питательная основа (бульон, агар), субстрат (моно- и дисахара, многоатомные спирты) и индикатор для выявления соответствующих ферментов. Ферментативное расщепление субстратов приводит к сдвигу рН и изменению окраски среды. Наиболее распространены цветные среды с различными углеводами (например, с бромтимоловым синим, индикатором ВР). Также широко распространены среды Гисса, на которых учитывают различия в способности ферментировать различные углеводы с образованием кислоты, либо кислоты и газа.

Для дифференцировки энтеробактерий применяют пептонную воду с набором различных углеводов, индикатором Андреде и поплавками, облегчающими обнаружение газообразования и помогающие визуально определить изменение рН, характерное для различных микроорганизмов. В частности, сдвиг в кислую сторону вызывает покраснение среды с реактивом Андреде или пожелтение при использовании среды с бромтимоловым синим, тогда как при защелачивании индикатор Андреде и бромтимоловый синий не меняют цвет среды. Например, для выделения патогенных бактерий из кишечника применяют среды, которые позволяют дифференцировать патогенные микроорганизмы от постоянных обитателей кишечника — микроорганизмов, разлагающих лактозу.

Такой средой является среда Эндо. Основными компонентами среды Эндо являются МПА, лактоза и основной фуксин, обесцвеченный сульфитом натрия. Исходная питательная среда окрашена в светло-розовый цвет. При сбраживании лактозы образуется ацетальдегид, который реагирует с сульфитом и, высвободившийся при этом, фуксин окрашивает колонии в ярко-красный цвет. Поэтому кишечная палочка, которая сбраживает лактозу, при росте на этой среде образует красные колонии с металлическим блеском, а сальмонеллы и шигеллы — бесцветные, так как они не сбраживают лактозу.

4. Среды накопления, на которых происходит быстрый рост определенных видов микроорганизмов.

5. Консервирующие (транспортные) среды. Предназначены для сохранения микроорганизмов во время транспортировки к месту исследования. Эти среды, содержат добавки, предупреждающие размножение и гибель микробов, что способствует сохранению их жизнеспособности. Наибольшее применение нашли глицериновая смесь (среда Тига), фосфатно-буферная смесь и среды Кари-Блэйра, Амиеса (с активированным углем и без активированного угля), Стюарта и др.

Стерилизация питательных сред.

Все питательные среды независимо от их назначения разливают в чистую посуду и стерилизуют. Большинство сред стерилизуют автоклавированием, но при различных режимах в зависимости от их состава.

1. Синтетические среды и все агаровые среды, не содержащие в своем составе нативного белка и углеводов, стерилизуют 15-20 мин в автоклаве при температуре 115-120°С и давлении 1-1,5 атмосферы.

2. Среды с углеводами и молоком (в состав которого входит лактоза), питательный желатин стерилизуют текучим паром при температуре 100°С дробно или в автоклаве при 112°С и при давлении до 1 атмосферы.

3. Среды, в состав которых входят белковые вещества (сыворотка крови, асцитическая жидкость), обеспложиваются тиндализацией или фильтрованием.

4. Для стерилизации питательных сред, содержащих в своем составе нативные белки, пользуются фильтрацией через мембранные фильтры Зейтца.

Для контроля стерильности среды после стерилизации помещают в термостат при 37°С на 3-5 сут. Жидкие среды должны оставаться прозрачными, а на поверхности и в толще плотных питательных сред не должны появляться признаки роста. Кроме контроля стерильности, про-изводят химический контроль готовых сред, который заключается в том, что в нескольких об-разцах каждой серии определяют рН, количество общего и аминного азота и хлоридов.

Существует также биологический контроль сред. В этом случае несколько образцов среды засевают лабораторной культурой того микроба, для которого приготовлена среда, и изучают характер его роста. Только после того, как среды выдержали контроль, их можно использовать по назначению.