Питательные среды

Любая микробиологическая работа и, следовательно, выполнение любой практической задачи связаны с приготовлением питательных сред для выращивания микроорганизмов.

Среды необходимы для накопления, выделения и сохранения микроорганизмов, а также для выращивания культур с целью исследования их обмена веществ или получения ценных продуктов метаболизма. Среда должна включать все компоненты, необходимые для конструктивных и энергетических процессов клетки,- источники углерода, азота, зольные элементы.

Синтетические возможности микроорганизмов и способы получения ими энергии разнообразны, поэтому различны их потребности в источниках питания. Следовательно, универсальных сред, одинаково пригодных для роста всех без исключения микроорганизмов, не существует. Разнообразие обмена веществ микроорганизмов проявляется, прежде всего, в их отношении к источникам углерода и азота; вот почему эти элементы представлены в средах различными веществами и именно они определяют специфичность сред.

Автотрофные микроорганизмы способны использовать в качестве единственного источника углерода углекислоту воздуха или карбонатов, тогда как потребности в углероде гетеротрофных микроорганизмов такими соединениями углерода не могут быть удовлетворены. Для развития гетеротрофных микроорганизмов среда должна содержать более восстановленные соединения углерода, которые в зависимости от физиолого-биохимических особенностей организма могут быть представлены различными органическими соединениями, например, кислотами, спиртами, углеводами, углеводородами.

Неодинаковы требования микроорганизмов и к источнику азота. Для культивирования микроорганизмов, фиксирующих молекулярный азот, используют среды, не содержащие соединений азота. В состав всех других сред входят различные азотсодержащие соединения. Это могут быть нитраты или соли аммония, одна или несколько аминокислот. Наконец, известны микроорганизмы, нуждающиеся в полном наборе аминокислот или белках.

Потребности разнообразных групп микроорганизмов в зольных элементах и микроэлементах удовлетворяются обычно за счет одних и тех же минеральных солей, поэтому так называемый "минеральный фон" сред для многих микроорганизмов может быть очень близким по составу.

Кроме элементов, необходимых для конструктивных процессов, среда должна содержать и энергетический материал. В средах для культивирования гетеротрофных организмов соединения углерода в большинстве случаев являются и энергетическим материалом. В средах для хемоавтотрофных организмов эту роль выполняют минеральные соли.

Из вышесказанного ясно, что при составлении сред следует обязательно учитывать особенности обмена веществ микроорганизмов. Кроме того, среды для одного и того же микроорганизма могут быть разными в зависимости от задач исследования. Например, среда для длительного сохранения микроорганизма в лабораторных условиях заметно отличается от сред, предназначенных для получения тех или иных продуктов обмена веществ.

Однако какой полноценной ни была бы среда, ее компоненты могут остаться недоступными, если активная кислотность среды (рН) соответствует значениям, при которых возможно развитие изучаемых организмов. Поэтому, приготовив среду, проверяют значение рН и, если необходимо, доводят его до нужной величины растворами кислот (HCl, Н₂SO₄), щелочей (NaOH, KOH) или солей, имеющих щелочную реакцию (Na₂CO₃, NaHCO₃). В процессе стерилизации значение рН сред может изменяться, поэтому нередко требуется дополнительное определение его в стерильных средах и в случае необходимости корректирование стерильными растворами кислоты или щелочи.

По составу среды для культивирования делят на две группы:

- естественные, или натуральные, среды неопределенного состава;

- синтетические среды.

Натуральными называют среды, которые состоят из продуктов животного и растительного происхождения. К таким средам относятся овощные или фруктовые соки, животные ткани, разведенная кровь, молоко, вода морей, озер и минеральных источников, а также отвары или экстракты, полученные из природных субстратов, как например, мясо, навоз, почва, различные части растений. На натуральных средах хорошо развиваются многие микроорганизмы, так как в таких средах имеются, как правило, все компоненты, необходимые для их роста и развития. Однако эти среды имеют сложный, непостоянный химический состав и мало пригодны для изучения физиологии обмена веществ микроорганизмов, так как не позволяют учесть потребление ряда компонентов среды и образование продуктов обмена по ходу развития. Натуральные среды используют главным образом для поддержания культур микроорганизмов, накопления их биомассы и диагностических целей.

Примерами натуральных сред неопределенного состава, которые широко применяют в лабораторной практике, служат мясопептонный бульон, неохмеленное пивное сусло, дрожжевая и картофельная среды, почвенная вытяжка.

Неохмеленное пивное сусло - хорошая среда для некоторых молочнокислых и уксуснокислых бактерий, дрожжей, плесневых грибов и других представителей гетеротрофных микроорганизмов, использующих сахара в качестве источника углерода и энергетического материала. В сусле содержатся аминокислоты, элементы нуклеиновых кислот, витамины (в основном группы В), безазотистые органические кислоты, минеральные соли, большое количество углеводов (до 20%, из которых 80% составляет мальтоза), т.е. все, что необходимо для развития наиболее требовательных сапрофитных микроорганизмов.

Дрожжевая среда используется для культивирования различных представителей гетеротрофных микроорганизмов. Основа дрожжевых сред - дрожжевая вода. Для ее приготовления 70-100 г свежих прессованых или 7-10 г сухих дрожжей заливают 1 л водопроводной воды и кипятят смесь в течение 10-30 мин. К фильтрату добавляют 1 л воды, еще раз 30 мин кипятят и вновь фильтруют. К полученной дрожжевой воде добавляют углеводы (1-2%) и минеральные соли, чаще всего К₂НРО₄ (0,1%) и NаСl (0,5%). Доводят значение рН среды до 6,8-7,2, разливают среду в необходимую посуду и стерилизуют при 0,5 атм 20-30 мин.

Картофельная среда используется в основном для выделения и культивирования видов рода Clostridium и других представителей амилолитических бактерий. Для приготовления этой среды отобранные клубни нарезают, заливают 1 л водопроводной воды, кипятят 15 мин и разливают в сосуды для культивирования. Картофельную среду стерилизуют при 1,5 атм 30 мин.

Почвенная вытяжка применяется для выделения и культивирования почвенных микроорганизмов. Для ее приготовления 1 кг богатой гумусом почвы заливают 1 л водопроводной воды и полученную смесь кипятят в течение 30-40 мин.

Синтетические среды - это среды, в состав которых входят лишь соединения определенного химического состава, взятые в точно указанных концентрациях. Синтетические среды используют при исследовании обмена веществ, физиологии и биохимии микроорганизмов. Зная точный состав и количество входящих в среду компонентов, можно изучить их потребление и превращение в соответствующие продукты обмена.

Для разработки синтетических сред необходимо знать потребности микроорганизмов в источниках питания и основные особенности их обмена веществ. В распоряжении микробиологов есть достаточное количество синтетических сред, не уступающих по своим качествам натуральным средам неопределенного состава. В зависимости от потребностей микроорганизмов синтетические среды могут иметь относительно большой набор компонентов, как, например, среды для ряда молочнокислых бактерий, но могут быть и довольно простыми по составу, как среды для автотрофных микроорганизмов.

В большинстве случаев синтетические среды готовят на водопроводной воде и микроэлементы не добавляют, так как они в небольших количествах всегда содержатся в водопроводной воде и могут поступать в среду из стекла посуды. Как правило, ограничиваются внесением только тех микроэлементов, к которым изучаемый микроорганизм проявляет повышенную требовательность.

В специальных средах, например, при изучении потребностей микроорганизмов в отдельных компонентах минеральных солей, для приготовления синтетических сред используют дистиллированную воду. В этом случае микроэлементы вносят обязательно.

Полусинтетические среды - это среды, в состав которых наряду с соединениями известной химической природы входят вещества неопределенного состава. Такие среды широко используются в технической микробиологии для получения аминокислот, витаминов и других важных продуктов жизнедеятельности микроорганизмов.

К полусинтетическим средам относятся, например, мясопептонный бульон с глюкозой и фосфорнокислым калием, картофельная среда с глюкозой и пептоном. Основой в указанных средах является компонент неопределенного состава.

К полусинтетическим средам следует отнести также среды, главными частями которых являются соединения известного состава: углеводы, нитраты или соли аммония, фосфаты и другие, - а соединения неопределенного состава - гидролизат казеина, дрожжевой автолизат, кукурузный экстракт - добавляются в качестве факторов роста и витаминов.

Гидролизат казеина используют главным образом как источник аминокислот. Чаще всего его готовят путем кислотного гидролиза. В таком гидролизате полностью отсутствует триптофан.

Дрожжевой автолизат используют как источник витаминов, аминокислот, в том числе триптофана, и других факторов роста, в частности пуринов и пиримидинов. К средам дрожжевой автолизат добавляют в таком количестве, чтобы концентрация аминного азота в среде составляла 5-30 %.

Кукурузный экстракт используют в качестве источника аминокислот и витаминов. Он содержит также большое количество органических кислот (молочной, уксусной и муравьиной) и зольных элементов. Кукурузный экстракт - готовый продукт заводов крахмалопаточной промышленности. В среду вносят в количестве от 0.5 до 4 % (вес/объем среды) в зависимости от потребностей организма.

По назначению различают питательные среды:

- элективные;

- дифференциально - диагностические (индикаторные) среды.

Элективные среды обеспечивают преимущественное развитие одного вида или группы микроорганизмов и менее пригодны или даже совсем непригодны для развития других. Элективные среды применяют главным образом для выделения микроорганизмов из мест их естественного местообитания или для получения накопительных культур.

Накопительной называют такую культуру, в которой преобладают представители одной физиологической группы или даже одного вида микроорганизмов. Метод накопительных культур был введен в практику микробиологических исследований С.Н.Виноградским и М. Бейеринком. Сущность его заключается в создании элективных, т.е. избирательных условий, которые обеспечивают преимущественное развитие желаемых микроорганизмов или группы микроорганизмов из смешанной популяции.

При создании элективных условий необходимо знать физиологию или четко представлять те особенности, которыми должны обладать выделяемые микроорганизмы. Элективные условия создают чаще всего, подбирая соответствующие среды, поскольку различные микроорганизмы для своего развития предъявляют неодинаковые требования к источникам питания. Например, микроорганизмы, способные фиксировать молекулярный азот, могут расти в среде, из состава которой исключены связанные формы азота. Если внести в такую среду почву, то из громадного разнообразия имеющихся в ней микроорганизмов в первую очередь будут развиваться азотфиксаторы. Накопительные культуры автотрофных микроорганизмов получают на средах, где единственным источником углерода служит углекислота. Отсутствие в среде других соединений углерода задерживает развитие гетеротрофов. Такие специфические питательные среды, удовлетворяющие потребности преимущественно одной группы микроорганизмов, носят название элективных. В зарубежной литературе большее распространение получили термины "накопительные" или "селективные" среды.

Дифференциально-диагностические (индикаторные) среды позволяют достаточно быстро отличить одни виды микроорганизмов от других. Состав этих сред подбирают с таким расчетом, чтобы он позволил четко выявить наиболее характерные свойства определенного вида. Индикаторные среды применяются в клинической бактериологии, при генетических исследованиях, а также для идентификации микроорганизмов. Так, при определении видовой принадлежности микроорганизмов используют рН-индикаторные среды, в состав которых вносят один из индикаторов, например нейтральный красный – 0,0005% или феноловой красный – 0,005%. Если использование углевода среды сопровождается образованием кислоты, то изменяется цвет индикатора. Это дает возможность быстро определить, какие из исследованных углеводов используют с образованием кислот.

По физическому состоянию различают:

- жидкие;

- плотные;

- сыпучие среды.

Жидкие среды широко применяют для выяснения физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов, для накопления биомассы или продуктов обмена, а также поддержания и хранения многих микроорганизмов, плохо развивающихся на плотных средах.

Плотные среды используют для выделения чистых культур (получение изолированных колоний) в диагностических целях (установление морфологии колоний, особенностей роста на скошенном агаре и др.), для хранения культур, количественного учета микроорганизмов, определения их антагонистических свойств и в ряде других случаев.

Сыпучие среды применяют в промышленной микробиологии. К ним относятся, например, разваренное пшено, отруби, кварцевый песок, пропитанные питательным раствором.