Дифференциально-диагностические среды

Среда Штерна. Используют для дифференциации сальмонелл. К 1000 см³ МПБ или бульона Хоттингера добавляют 2,5 см³10%-ного насыщенного спиртового раствора основного фуксина, 16,6 см³10%-ного водного раствора натрия сульфита (Na₂S0₄) и 10 см³ глицерина. Разлива­ют по пробиркам и стерилизуют 15 мин при 112° С. Готовая среда имеет желтую окраску. Если испытуемая культура относится к S. typhimurium, которая способна ферментировать глицерин, то среда приобретает фиоле­товый оттенок.

Среда Биттера. Используют для дифференциации сальмонелл. В 1000 см³ дистиллированной воды растворяют 0,05 г пептона, 0,5 г на­трия цитрата, 5 г натрия хлорида, 5 г рамнозы (или арабинозы). Кипятят на водяной бане 3-5 мин, фильтруют через бумажный фильтр. Разливают по пробиркам и стерилизуют 30 мин при 112° С или текучим паром 3 дня под­ряд по 30 мин. Если испытуемая культура относится к сальмонеллам, спо­собным ферментировать рамнозу или арабинозу (S. typhimurium), то при добавлении к суточной культуре (выращенной на данной среде) 2 капель 0,5%-ного спиртового раствора метилового красного среда приобретает красную окраску.

Среда для посева по Свену - Гарду. Используют для выявления у саль­монелл специфической фазы жгутикового антигена. К 1000 см³ МПБ или бульона Хоттингера добавляют 8 г агара и раство­ряют путем кипячения на водяной бане. Устанавливают рН 7,2-7,4, филь­труют через бумажный фильтр и стерилизуют 30 мин при 121° С.

Среды с аминокислотами. Используют для определения способности энтеробактерий в анаэробных условиях расщеплять левовращающие ами­нокислоты — лизин, орнитин, аргинин. В 600 см³ дистиллированной воды растворяют 5 г пептона и 1 г глюкозы, устанавливают рН 6,0-6,1. Приготовленный раствор разливают по 150 см³ в четыре колбы. В каждую из трех колб вносят по 10 г одной из аминокислот. Четвертая колба остается в качестве контрольной. Содержимое всех колб кипятят на водяной бане 5-10 мин, устанавливают рН 6,0-6,1. Во все че тыре колбы вносят по 0,6 см³ 1,6%-ного спиртового раствора бромкрезоло-вого пурпурного или бромтимолового синего и по 5 см³ 0,1%-ного спиртово­го раствора крезолового красного. Разливают в агглютинационные пробир­ки по 2-3 см³ и стерилизуют 30 мин при 110° С.

Для проведения теста в пробирки, содержащие аминокислоту, и в конт­рольную пробирку засевают испытуемую культуру, после чего заливают стерильным вазелиновым маслом (слоем толщиной 10 мм) и инкубируют. Учет проводят в течение 4 сут. При положительной реакции среды с амино­кислотами приобретают фиолетовую или синюю (в зависимости от индика­тора) окраску, в контрольных пробирках среда имеет желтую окраску.

Состав 1,6%-ного спиртового раствора бромкрезолового пурпурного: бромкрезоловый пурпурный — 1,6 г, спирт этиловый 96° — 100 см³.

Состав 0,1%-ного спиртового раствора крезолового красного: крезоловый красный — 0,1 г, спирт этиловый 96° — 100 см³.

Среды, содержащие органические кислоты. Используют для дифферен­циации сальмонелл по их способности расщеплять органические кислоты (тартраты, мукаты, натрия цитрат). В 1000 см³ дистиллированной воды растворяют 10 г пептона, добавля­ют 8,5 см³ 0,1 Н раствора натрия гидроокиси, 12 см³ 0,25%-ного водного ра­створа бромтимолового синего, 10 г D-тартрата (или одну из следующих кислот: 5 г L-тартрата, 5 г мезотартрата, 10 г муката, 10 г натрия цитра­та). Устанавливают рН 7,4, разливают в пробирки и стерилизуют 20 мин при 112° С. Готовая среда синезеленого цвета. При положительной реакции в процессе инкубации среда с культурой приобретает зелено-желтую окраску.

Для получения более четких результатов в конце срока инкубации в пробирки с сомнительной или отрицательной реакцией добавляют несколь­ко капель насыщенного раствора ацетата свинца, в результате при отрица­тельной реакции выпадает обильный осадок (до ²/₃ объема среды), при по­ложительной — выпавший осадок незначителен.

Среда с триптофаном. Используют для определения у бактерий нали­чия триптофандезаминазы. В 1000 см³ дистиллированной воды растворяют 2 г DL-триптофана. Устанавливают рН 6,7-6,9. Для определения способности бактерий к дезаминированию триптофана испытуемую агаровую культуру бакте­риологической петлей вносят в пробирку с 0,5 см³ раствора триптофана и инкубируют 30 мин при 37° С, после чего вносят
1 каплю 10%-ного водного раствора железа хлористого трехвалентного (FeCl₃). При поло­жительной реакции среда приобретает темно-красную окраску, при от­рицательной — желтую.

Среда с калием цианидом. В 1000 см³ дистиллированной воды раство­ряют 10 г пептона, 5 г натрия хлорида, 0,225 г калия дигидрофосфата (КН₂Р0₄), 5,64 г натрия гидрофосфата (Na,HP0₄). Устанавливают рН 7,6, фильтруют через бумажный фильтр и стерилизуют 30 мин при 112° С. Пос­ле стерилизации быстро охлаждают. Среду этого состава используют в качестве контрольной. Непосредственно перед применением к 100 см³ сре­ды асептически добавляют 1,5 см³ свежеприготовленного 0,5%-ного вод­ного раствора калия цианида (KCN), разливают по пробиркам и закры­вают корковыми пробками.

Пробу считают положительной, если через 24-48 ч после посева куль­туры в среде заметно помутнение или опалесценция. При отрицательном результате среда остается абсолютно прозрачной, в то время как в конт­рольной пробирке заметно помутнение.

Среда Клиглер. Используют для определения образования сероводорода. В 1000 см³ МПБ растворяют при кипячении 20 г пептона, 5 г натрия хло­рида, 0,4 г натрия сульфида, 0,08 г натрия тиосульфата, 20 г агара. Устанав­ливают рН 7,8, затем снова кипятят, фильтруют через бумажный фильтр и добавляют 0,5 г железа сернокислого, растворенного в небольшом количе­стве воды, 10 г лактозы, 1 г глюкозы и 12 см³ 0,2%-ного раствора фенолрота в 50%-ном спирте. Среду разливают по 6-7 см³ в пробирки и стерилизуют 30 мин при 112° С. Среда имеет оранжево-красную окраску. При образовании сероводорода среда окрашивается в черный цвет.

Среда Кларка. Используется для постановки реакции Фогес-Проскауэра и пробы с метиловым красным для определения окисления глюкозы с образованием 2-кетоглюконата. В 100 см³ дистиллированной воды растворяют 0,5 г калия гидрофосфа­та (К₂НР0₄), 0,7 г пептона, 0,5 г глюкозы. Кипятят 2-3 мин, фильтруют через бумажный фильтр, устанавливают рН 6,9, разливают по пробиркам и стерилизуют 15 мин при
111° С.

Реакцией Фогес-Проскауэра выявляют промежуточный продукт рас­щепления глюкозы — ацетилметилкарбинол (ацетоин). Для этого испытуе­мую культуру выращивают на среде Кларка 4-5 дней в 2 пробирках. Одну пробирку культивируют при 25° С, другую при 37° С. Из обеих пробирок по 1 см³ культуры переносят в другие пробирки и добавляют 0,6 см³ 5%-ного спиртового раствора а-нафтола, смесь перемешивают. Затем добав­ляют 0,2 см³.40%-ного водного раствора КОН. Тщательно перемешивают и инкубируют 1 ч.

Учет реакции проводят через 15 и 60 мин. Положительная реакция — вишневое окрашивание среды.

Тестом с метиловым красным устанавливают снижение рН среды при расщеплении глюкозы до 4,4-6,0. Раствор метилового красного готовят добавлением к 0,1 г метилрота 300 см³ 95%-ного этанола. После растворения красителя добавляют 200 см³ дистиллированной воды.

Для постановки теста в пробирку с 5 см³ среды Кларка вносят петлю испытуемой культуры и инкубируют 2-5 сут при 25° С. Затем добавляют 5-6 капель реактива метиловый красный и следят за изменением окраски. При положительном результате (рН 4,0-6,0) среда приобретает красный цвет. При отрицательном результате (рН 6,0-7,0) среда приобретает жел­тый цвет.

Среда с мочевиной по Кристенсену. Используют для определения спо­собности бактерий к гидролизу мочевины (уреазная активность) с образо­ванием аммиака и углекислоты. В 1000 см³ дистиллированной воды растворяют 1 г пептона, 5 г натрия хлорида, 2 г калия дигидрофосфата (КН₂Р0₄), 20 г агара. Смесь стерилизу­ют 20 мин при 115° С. Затем вносят 1 г глюкозы и 6 см³ 0,2%-ного раствора фенилрота, стерилизуют текучим паром 1 ч, охлаждают до 50° С и асептичес­ки добавляют 100 см³ 20%-ного водного раствора мочевины, стерилизован­ного фильтрацией. Среду разливают по пробиркам и скашивают.

Испытуемую культуру засевают на поверхность скошенного агара и культивируют 1-4 сут. Положительный результат (защелачивание сре­ды) — красно-малиновое окрашивание среды.

Среда Симмонса. Используют для определения способности бактерий утилизировать цитрат как единственный источник углерода. Состав: агар — 20 г, NaCl — 5 г, MgS0₄ х 7Н₂0 — 0,2 г, К₂НР0₄ — 1 г, NH₄ х Н₂Р0₄ — 1 г, C₆H₅0_?Na₃ х 5Н₂0 — 3 г, бромтимоловый синий — 0,08 г, вода дистиллированная — 1000 см³.

В дистиллированной воде растворяют агар. Соли растворяют отдельно в небольшом объеме воды и затем смешивают с агаром, до объема 1000 см³. Устанавливают рН 7,2, добавляют 40 см³ 0,2%-ного водного раствора бромтимолового синего. Среду перемешивают, разливают в пробирки по 5-7 см³ и стерилизуют 15 мин при 121° С. После автоклавирования агар ска­шивают.

Испытуемую культуру засевают на поверхность агара и инкубируют. При положительном результате отмечают рост культуры на среде и измене­ние ее цвета с оливкового на синий.

Среда с алгинатом натрия. Используют для определения способности бак­терий утилизировать натрия алгинат как единственный источник углерода. Состав среды аналогичен составу среды Симмонса, но вместо натрия цитрата вносится 2,5 г натрия алгината. Положительным считают изменение цвета среды. Микроорганизмы, не обладающие способностью усваивать натрия алгинат, на данной среде не растут.

Среды Гисса. Используют для изучения способности ферментации угле­водов с образованием кислоты и газов. Состав: пептон — 10 г, натрия хлорид — 5 г, вода дистиллированная — 1000 см³, 0,1%-ный индикатор Андреде, углевод 0,5% (адонит, глицерин, сор­бит, дульцит, целлобиоза, раффиноза, трегалоза, салицин, арабиноза, мальто­за, рамноза, ксилоза) или 1,0% (глюкоза, лактоза, маннит, сахароза).

В дистиллированной воде растворяют навески пептона, натрия хлорида, добавляют индикатор, фильтруют через бумажный фильтр, устанавливают рН 7,1-7,2 и стерилизуют 15 мин при 111 ° С. Затем добавляют углевод. Приготовленную среду разливают по пробиркам и стерилизуют
15 мин при 110° С.

Среда для выявления фенилаланиндезаминазы. Состав: сухой дрожжевой экстракт—3 г, натрий хлористый — 5 г, L-фенилалапин — 1 г, Na₂HP0₄ — 1 г, агар — 12 г, вода дистиллированная — 1000 см³. Смешивают воду и дрожжевой экстракт, нагревают, добавляют компо­ненты и кипятят до расплавления агара, рН среды 7,0-7,2. Горячую среду фильтруют, разливают в пробирки по 2-3 см³ и стерилизуют 30 мин при 112° С. Среду скашивают.

Испытуемую культуру засевают штрихом по поверхности агара и через сутки инкубации добавляют на поверхность культуры несколько капель 10%-ного водного раствора железа хлорида (FeCl₃). При дезаминировании фенилаланина среда окрашивается в зеленый цвет, при отрицательном результате сохраняется желтое окрашивание.

Среда для выявления β-галактозидазы. В 100 см³ расплавленного и охлажденного до 40-45° С МПА асепти­чески добавляют 20 см³ 1%-ного водного раствора О-нитрофенил-β-D-галактопиранозид. Среду разливают по пробиркам.

Испытуемую культуру засевают уколом петлей до дна пробирки. Посевы инкубируют 24 ч при 37° С.

При положительной реакции среда окрашивается в желтый цвет одним из конечных продуктов гидролиза О-нитрофенил-β-D-галактопиранозида О-нитрофенолом.

Среды для выявления лизиндекарбоксилазы, орнитиндекарбоксилазы и чргининдегидролазы. Состав: мясная вода — 400 см³, пептон — 5 г, глюкоза — 1 г, вода дистиллированная — 600 см³, 0,1%-ный спиртовой раствор крезолового красного — 5 см³, 1,6%-ный спиртовой раствор бромкрезолового пурпурного — 0,6 см³, L-лизин (или орнитин, или аргинин) —10 г.

Мясную воду, пептон, глюкозу и дистиллированную воду смешивают, устанавливают рН 6,0-6,1. Вносят аминокислоту, кипятят 8-10 мин, до­бавляют индикатор и разливают в агглютинационные пробирки по
3 см³. Стерилизуют 30 мин при 110° С. Цвет среды розовый.

Испытуемую культуру засевают в среды с аминокислотами (опыт) и среду безаминокислоты (контроль). Во все пробирки вносят стерильное вазелиновое иасло до получения слоя в 4-5 мм. Пробирки инкубируют 4 дня при 37° С.

При положительной реакции (защелачивание среды) наблюдается синee окрашивание в опытных пробирках и желтое — в контрольной.

Среда для определения пиразинамидазной активности у Y.enterocolitica. Состав: трипсинизированный соевый агар — 30 г, дрожжевой экстракт сухой — 3 г, пиразинкарбоксиамид — 1 г, трисмалат буфер 0,2 М, рН 6,0-1000 см³.

Составные части среды смешивают и подогревают на водяной бане до их растворения. Разливают по 5 см³ в пробирки, стерилизуют 30 мин при 112° С и скашивают.

Среда для определения калъцийзависимости роста у Y. Enterocolitica. В качестве питательной основы используют коммерческую среду для определения чувствительности бактерий к антибиотикам (агар АГВ).

К стерильному расплавленному и охлажденному до 50° С агару добав­ляют (из расчета на 100 см³) 8 см³ 0,25 М стерильного натрия щавелевокис­лого, среду тщательно перемешивают и вносят 4 см³ 0,5 М стерильного раствора магния хлорида. Готовую среду разливают по чашкам Петри.

Определение индолообразования. Испытуемую культуру выращивают в пробирке с бульоном Хоттингера. В пробирку с культурой вносят 2-3 капли эфира, тщательно ее встря­хивают, оставляют в покое до отстаивания на поверхности среды слоя эфи­ра. Осторожно добавляют
0,5 см³ реактива Эрлиха, выдерживают 5 мин и учитывают результат. При наличии индолообразования слой эфира приоб­ретает розово-красный цвет.

Для приготовления реактива Эрлиха в 95 см³ 96%-ного этанола раство­ряют 1 г парадиметиламинобензальдегида и добавляют 20 см³ концентри­рованной хлористоводородной кислоты (НС1).