Механизм повреждений при заморозке

Есть несколько причин, по которым клетки и ткани животных часто не выживают после глубокой заморозки, последующего хранения и нагревания.

Прежде, чем мы перечислим эти возможные причины повреждений при заморозке, следует отметить, что «не выживают» — это очень неопределенное и, возможно, вводящее в заблуждение выражение. Обычный критерий выживания — это возобновление функционирования в случае с органом или рост клеточной культуры или успешная трансплантация или автореплантация (пересадка ткани обратно в животное-донор) в случае с тканью. Ткань, находящаяся лишь немного ниже границы выживания называется «мертвой», а эксперимент, в котором лишь небольшая доля клеток выживает, обычно считается неудавшимся. Но на самом деле, почти удавшиеся и частично удавшиеся эксперименты дают значительные основания для оптимизма, поскольку они указывают на сравнительно небольшой объем повреждений.

Ниже перечислено несколько отдельных видов повреждений при заморозке, хотя не все из них являются взаимоисключающими.

1. Возможны механические повреждения при формировании кристаллов льда.

Наиболее очевидная возможность повреждений связана с колющим, давящим или разрывающим действием формирующихся ледяных кристаллов на клеточные мембраны и целые клетки. Странно, однако, что подобные результаты наблюдаются довольно редко, хотя иногда это и может происходить. (В случае с растительными клетками, с их более жесткими мембранами, подобные повреждения происходят намного легче.)

При медленном охлаждении со скоростью около одного градуса в минуту чистый лед постепенно отделяется от клеточного раствора, и кристаллы льда формируются за мембраной в межклеточном пространстве. Более медленное охлаждение увеличивает размер формирующихся кристаллов и уменьшает их число; более быстрое охлаждение — наоборот. По достижении так называемой эвтектической температуры[21] остаток раствора замерзает и превращается в смесь кристаллов льда и различных солей и гидроксидов.

Существует достаточно доказательств того, что формирование кристаллов льда не всегда смертельно, несмотря на то, что вода при замерзании расширяется. Меримен пишет: «Экспериментальные работы в области обморожений показали, что нога собаки может выдержать охлаждение тканей до температур существенно ниже точки замерзания на время до тридцати минут... Нет никакого сомнения, что ледяные кристаллы формируются, но, несмотря на это, ткань выживает... довольно уверенно можно утверждать, что в мягких тканях, свойственных представителям Царства животных, возможно формирование ледяных кристаллов в межклеточном пространстве и значительное сжатие ими клеток без негативного воздействия на выживаемость последних». (70)

При быстрой заморозке формируются кристаллы льда значительно меньшего размера, и, возможно, именно поэтому, опасность механических повреждений намного меньше, хотя общий объем льда, естественно, не меняется. С другой стороны, при быстрой заморозке вода не успевает покинуть клетку, из-за чего формируются небольшие внутриклеточные или даже внутриядерные кристаллы льда, что создает опасность повреждений. Размер этой опасность сложно оценить, но она может быть значительной — кристаллы льда могут, к примеру, повредить ядро клетки.

2. Возможна опасная концентрация электролитов.

Поскольку заморозка вызывает разделение воды (в виде льда) и растворенных в воде веществ, происходит дегидратация. Жидкость, остающаяся в клетке имеет необычайно высокую концентрацию солей и других веществ с близким строением, называемых «электролитами», которые обладают особыми электрическими и химическими свойствами. Подобные значительные изменения внутри клетки могут быть для нее губительными. (69)

Повреждения клетки зависят от концентрации электролитов, времени воздействия и температуры; меньшая температура означает меньшую скорость реакции. В зависимости от типа клетки и других факторов, концентрация электролитов становится опасно высокой при температурах от 0 C° до –25 C°. Следовательно, при отсутствии защитных вливаний охлаждение в этом интервале температур должно быть максимально быстрым.

Доктор Джей. Э. Лавлок полагает, что особой опасности денатурирования и изменения химических свойств подвержены липопротеины. «Частым, если не постоянно встречающимся, компонентом многих мембран в сложной живой клетке являются липо-протеидные комплексы... связанные не сравнительно сильными ковалентными связями, соединяющими атомы в простом белке, но слабыми ассоциативными силами, схожими с теми, что поддерживают мыльный пузырь... Эти комплексы часто нестабильны и, вероятно, постоянно обновляются с помощью внутриклеточного синтеза... Заморозка [легко может] денатурировать более чувствительные липопротеиновые комплексы живой клетки.

Высокая чувствительность липопротеиновых комплексов к неблагоприятным эффектам заморозки заставляет предположить, что не только главная клеточная мембрана, но и меньшие мембраны... могут получить необратимые повреждения во время заморозки. Глубокие изменения в окружении клетки, происходящие во время заморозки, также могут причинять вред более стабильным молекулярным компонентам клетки». (62)

Чтобы не нагнетать лишнего страху, стоит отменить, что далее он продолжает: «... многие живые клетки и ткани успешно хранились в замороженном состоянии... несмотря на эту огромную опасность».

Нельзя забывать также, что фраза «необратимые повреждения» используется слишком бесцеремонно и на самом деле означает лишь «повреждения, которые невозможно обратить с использованием доступных на сегодня методов».

3. Возможна неустойчивость обмена веществ.

Доктор Л. Р. Рей, выдающийся исследователь из парижской École Normale Supérieure, уверен, что клетки могут приходить в беспорядок из-за неравномерного воздействия холода на сбалансированные жизненные процессы. «Действие различных ферментов прекращается при различной температуре... это может приводить к ненормальному накоплению промежуточных продуктов обмена веществ, которые обычно существуют недолго и которые могут оказаться токсичными или направить обмен веществ в другом направлении». (90)

Это звучит довольно многообещающе, поскольку это дает надежду на то, что, изучив эти процессы и разработав средства для их корректировки, мы научимся восстанавливать нарушенный баланс обмена веществ.

Сходным образом прокомментировал ситуацию доктор Л. Крейхерг. «Является очевидным, что в областях организованной ткани in situ [на своем месте] пределы выживания клеток после заморозки... определяются не толерантностью отдельных клеток, но локальной реакцией на беспорядок в „социальной жизни“ клеток». (56) Можно предполагать, что схожий комментарий может относиться и к условиям внутри отдельной клетки и взаимодействию ее частей.

4. Возможен термальный шок и осмотический шок.

Быстрая заморозка оказывается смертельной для многих клеток по малоизученным пока причинам. Одна из гипотез, говорящая о «термальном шоке», предполагает, что различные вещества в клетках и мембранах при понижении температуры сжимаются с различной скоростью, что приводит к разрушительному механическому напряжению. «Осмотический шок» относится к неблагоприятным эффектам внезапных изменений в концентрации растворов, разделенных мембранами.

5. Возможны повреждения во время хранения.

Во время охлаждения клетка в каждом температурном диапазоне сталкивается, в зависимости от многих факторов, с различными превратностями и даже когда она, наконец, достигает температуры хранения, ее беспокойства еще не окончились. Как уже отмечалось, существуют свидетельства тому, что при всех температурах, кроме самых низких, близких к абсолютному нулю, со временем, хотя и очень медленно, происходят ощутимые изменения.

Хотя Фернандес-Моран отмечал, что активность свободных радикалов может продолжаться и при –196 C°, и предположил, что долгосрочное хранение, скорее всего, должно происходить при температуре жидкого гелия, тем не менее, большинство авторов согласны, что и хранение при температуре кипения азота, вероятно, вполне безопасно.

В любом случае, слово «разложение» плохо описывает порчу, которая происходит при низких температурах. Вполне вероятно, что в этом случае происходят не обычные процессы гниения и разложения или даже обычного, хотя и с пониженной скоростью, обмена веществ, а, скорее, несколько чувствительных процессов, идущих к своему завершению, после чего в течение неограниченно долгого времени состояние организма остается неизменным. Если это так, то охлаждение с помощью сухого льда на длительный период может быть таким же надежным, как и охлаждение жидким гелием, за исключением небольших первоначальных повреждений. По этому поводу, впрочем, я не могу сослаться на авторитетный источник, и многие вопросы пока остаются без ответа.

6. Возможны повреждения при нагревании.

Существует множество свидетельств того, что при нагревании наносятся большие повреждения, чем при заморозке, особенно, если нагревание производится медленно и при отсутствии защитных примесей. Механизм таких повреждений, вероятно, включает блуждающую рекристаллизацию льда (небольшие кристаллы могут соединяться в более крупные кристаллы, вызывая механические разрывы) и формирование пузырьков газа, а также другие процессы. Подобные эффекты могут происходить при температуре –40 C° и выше.

В течение некоторого времени предполагалось, что сложности, связанные с обеспечением быстрого нагревания, чрезвычайно серьезны для всех живых организмов, кроме самых мелких, для которых теплообмен не является проблемой. Однако сейчас стало ясно, что микроволновая диатермия и индуктивные методы позволяют добиться быстрого более или менее равномерного нагревания всего тела даже для крупных организмов. Эти методы включают использование высокочастотных радиоволн, переменных электромагнитных полей; первые аналогичны обыкновенной лампе-нагревателю, вторые — так называемым электронным духовкам. Устройства для нагревания были описаны Лавлоком. (61) С использованием подобных методов кролики могут быть нагреты в течение нескольких секунд. (110)

7. Возможны прочие вредоносные эффекты.

Различные свидетельства и предположения указывают на дополнительные возможности повреждений при заморозке. Лекарства и антибиотики, как и вещества, присутствующие в организме естественным образом, могут достигать смертельных концентраций. При температуре сухого льда при использовании глицерина возможно неполное замерзание, и слабая растворимость солей в глицерине может привести к медленным повреждениям. При чрезвычайно низких температурах полное замерзание воды может коснуться и молекул, необходимых для цельности белков. И так далее; многое уже известно, но куда больше только предстоит узнать.

Подводя итог, скажем: если нас интересует главная опасность для людей, замороженных без насыщения защитными веществами, согласованное мнение экспертов указывает на денатурацию белков, связанную с действием концентрированных солевых растворов, что, в свою очередь, является результатом слишком медленного охлаждения. Что касается возможности избежать этой опасности с помощью защитных агентов или увеличения скорости заморозки, то более подробно об этом будет рассказано позже.