Исследование компонентов внутриклеточных сигнальных систем обонятельных клеток, участвующих в рецепции различных одорантов

Участие внутриклеточных сигнальных систем в обонянии мы изучали методом флуоресцентного анализа кальций-аккумулирующей способности мембран обонятельных клеток с применением фармакологического анализа. Все необходимые для этого агенты готовили на растворе ХТЦ и вводили в проток для воздействия на выстилку.

Стимуляцию препарата осуществляли таким образом, чтобы воздушная струя, содержащая одорант, была направлена в ту область ольфакторного эпителия, с которой регистрировали флуоресцентный сигнал.

В ходе проведения экспериментов оказалось, что реакцию на тестируемый одорант можно было выявить не в любой области поверхности обонятельной выстилки. Поэтому, обнаружив зону, «чувствительную» к данному пахучему веществу, все дальнейшие манипуляции проводили, не сдвигая препарат с этого участка.

3.1.1. Исследование компонентов сигнальных систем,
участвующих в рецепции амилового спирта

Воздействие на обонятельную выстилку амиловым спиртом, обладающим прогорклым запахом, в 31 опыте приводило к усилению интенсивности флуоресценции на 20 – 45 отн. ед. (рис. 6 а). Продолжительность ответа зависела от его амплитуды и достигала 10 – 30 с, доходя до максимального значения за 3 – 5 с. Следовательно, под действием амилового спирта кальций-аккумулирующая способность клеточных мембран обонятельных клеток увеличивалась.

При обдувании обонятельной выстилки этим одорантом регистрировалась негативная волна электоольфактограммы, которая достигала максимума через 3 – 5 с и длилась около 10 с (рис. 6 б). Как видно, временные характеристики флуоресцентного и электрического сигналов совпадают, а это может, вероятно, свидетельствовать о том, что динамика флуоресенции, как и электроольфактограмма, отображает рецепторные процессы в обонятельных клетках.

Стимуляция препарата на фоне 2 мМ ЭГТА во всех опытах подавляла увеличение флуоресцентного сигнала (рис. 7). Известно, что ЭГТА связывает внеклеточный кальций. Следовательно, реакция на амиловый спирт исчезала в бескальциевой среде. Это, в свою очередь, означает, что для ее обеспечения необходим Са²⁺ в интерстиции.

Роль внутриклеточных Са²⁺-депо в реакции обонятельных кеток на амиловый спирт мы исследовали в 15 опытах посредством кофеина, который в концентрации 10 мМ опустошает внутриклеточные кальциевые хранилища, обеспечивая депо-зависимый вход Са²⁺ в цитозоль. Как видно на рис. 7, действие его на обонятельную выстилку не вызывало усиления флуоресценции, подобное амиловому спирту. Это означает, что повышение кальций-аккумулирующей способности мембран обонятельных клеток под действием амилового спирта не обусловливается усилением проницаемости для Са²⁺, вызванным истощением его запасов в эндоплазматическом ретикулуме.

На рис. 9 представлены данные, полученные при действии на обонятельную выстилку 100 мкМ кофеином (n=15), который в этой концентрации ингибирует фосфодиэстеразу, повышая тем самым внутриклеточное содержание цАМФ. Как видно, под его влиянием интенсивность флуоресценции препарта в зоне стимуляции не меняла своего значения. Следовательно, увеличение содержания цАМФ в цитозоле при выключении фосфодиэстеразы не влияло на кальций-аккумулирующую способность мембран исследуемых клеток подобно тому, как это делал амиловый спирт. Следовательно, увеличение флуоресцентного сигнала при стимуляции одорантом не индуцировалось повышением цитозольной концентрации циклонуклеотида, за счет ингибирования фосфодиэстеразы. Однако амплитуда сигнала и его длительность под действием амилового спирта на фоне кофеина увеличивались (рис.10). Вероятно, ФДЭ, снижая концентрацию цАМФ в цитозоле, участвует в регуляции ответа на одорант.

Роль активации аденилатциклазы в реакции рецепторных клеток на амловый спирт мы исследовали с помощью форсколина, специфически активирующего этот фермент. Данные предсталены на рис. 11, на котором видно, что аппликация форсколина (10 мкМ) на обонятельную выстилку усиливала световой сигнал, имитируя действие одоранта. Очевидно, этот эффект обусловлен активацией форсколином аденилатциклазы, гидролизующей АТФ с образованием цАМФ в обонятельных клетках. По-видимому, амиловый спирт увеличивал кальций-аккумулируюшую способность мембран обонятельных клеток по механизму, сходному с действием форсколина, то есть в результате активации аденилатциклазы.

Подтверждением этого вывода стала стимуляция обонятельной выстилки амиловым спиртом на фоне специфического ингибитора аденилатциклазы 2,5-дидеоксиаденозина. Во всех опытах выключение активности этого фермента полностью подавляло одорант-индуцируемое увеличение флуоресценции (рис. 12).

Чтобы определить участие G-белка в реакции на амиловый спирт, на обонятельную выстилку апплицировали AlF₄^-. Для этого на препарат сначала воздействовали фтористым натрием, а затем хлористым алюминием. Известно, что форалюминат активирует ГТФ-связывающий белок, минуя рецептор. На рис. 13 видно, что под его действием (n=7) флуоресцентный сигнал был сходен с тем, который регистрировали при стимуляции препарата амиловым спиртом. Сходство реакций под действием одоранта и фторалюмината свидетельствует о тождестве механизмов их действия на обонятельные клетки. Следовательно, кальций-аккумулирующая способность клеточных мембран изменяется в результате активации G-белка, происходящей под действием амилового спирта.

Вторым важным ферментов в аденилатциклазном пути трансдукции является ПКА. Ее участие в реакции на амиловый спирт мы изучали с помощью Н-7 в концентрации 50 мкМ, который является ингибитором этого фермента. Как показали результаты опытов, стимуляция препарата амиловым спиртом в присутствии в среде Н-7 (n=7) приводила к такому же усилению интенсивности флуоресценции, как и без него (рис.14). Это означает, что изменение кальций-аккумулирующей способности мембран обонятельных клеток под действием исследуемого одоранта не зависит от функционирования протеинкиназы А.

Мы показали, что основная роль в трансдукции амилового спирта в обонятельных клетках принадлежит внутриклеточной сигнальной системе цАМФ. Логично было предположить, что вход ионов кальция из внеклточной среды в цитозоль осуществляется через каналы, регулируемые циклическим адениозинмонофосфатом. Для проверки этого предположения мы использовали нефидипин (10 мкМ), который является ингибитором циклонуклеотид-зависимых кальциевых каналов в обонятельных клетках.

При обдувании обонятельной выстилки амиловым спиртом на его фоне во всех 7 опытах реакции на стимул не было (рис.15). Во-первых, это свидетельствует о том, что для увеличения кальций-аккумулирующей способности мембран ольфакторных клеток под действием одоранта требуется изменение проницаемости плазмолеммы для входа ионов кальция, а во-вторых, эта проницаемость регулируется циклическими нуклеотидами.

Характерной особенностью Са²⁺-каналов, управляемых цАМФ, является их способность к ингибированию при повышении концентрации ионов кальция как в интерстиции, так и в цитозоле. Для исследования влияния цитозольного кальция на циклонуклеотидзависимые каналы мы инкубировали обонятельную выстилку (n=5) в кальциевом ионофоре иономицине (1 мкМ), а для изучения воздействия на эти каналы ионов кальция из инерстиция повышали внем их содержание путем введения в бескальциевую среду 2 мМ СаCl₂ (n=8). Оказалось, что на фоне как иономицина, так и хлорида кальция стимуляция препарата амиловым спиртом не приводила к усилению Са²⁺-сигнала (рис.16, 17). Следовательно, кальций-аккумулирующая способность мембран обонятельных клеток увеличивается под действием амилового спирта в результате открывания циклонуклеотид-зависимых Са²⁺-каналов.

Иономицин используют также для доказательства участия в реакциях на стимулы фосфоинозитидной сигнальной системы (Авдонин, Ткачук, 1994). Известно, что повышение концентрации кальция в цитозоле активирует протеикиназу С, принадлежащую фосфоинозитидному пути трансдукции. В таком случае действие этого агента вызывает реакцию, сходную с исследуемой. На рис.18 видно, что под влиянием иономицина реакция обонятельной выстилки не регистрировалась. Значит, в обонятельных клетках, чувствительных к амиловому спирту, в реакцию не вовлекаются фосфоинозитиды. Таким образом, участие системы цАМФ в рецепции амилового спирта было нами подтверждено не только прямыми доказательствами, но и методом исключения.

Итак, под действием амилового спирта в обонятельных клетках активируется сигнальная система цАМФ, связанная с активацией аденилатциклазы, сопряженной с G-белком.

3.1.2. Исследование компонентов сигнальных систем,
участвующих в рецепции камфоры

Обдувание обонятельной выстилки камфорой, принадлежащей группе одорантов с камфорным запахом, вызывало увеличение интенсивности флуоресценции в довольно большом диапазоне – от 45 до 370 отн. ед. (n=38). При этом время достижения максимального ответа не зависело от амплитуды ответа и варьировало от 3 до 5 с. Реакция на одорант длилась 20 – 25 с (рис.19 а). Следовательно, под влиянием камфоры кальций-аккумулирующая способность мембран обонятельных клеток увеличивалась.

Следует отметить, что было очень сложно обнаружить область обонятельной выстилки, чувствительную к этому одоранту. Такой факт может, вероятно, свидетельствовать о небольшом числе зон, в которых сосредоточены рецепторные клетки, воспринимающие камфорный запах.

На рис. 19 б видно, что при стимуляции обонятельного эпителия камфорой регистрируется отрицательный потенциал, который, как известно, генерируется рецепторными клетками. Максимальное значение его достигалось через 3 - 5 с после воздействия, а через 15 – 20 с он возвращался к изолинии. Сходная кинетка этих двух реакций указывает, вероятно, на то, что обе они характеризуют поведение рецепторных клеток.

Роль внеклеточного кальция мы определяли с помощью ЭГТА. Для этого обонятельную выстилку помещали в 2 мМ раствор ЭГТА, и на его фоне стимулировали рецепторные клетки камфорой. На рис. 20 видно, что в данных условиях реакции на стимул не было. Следовательно, в ответе на камфору принимают участие ионы кальция из внеклеточной среды.

Участие аденилатциклазы в реакции на камфору исследовали посредством стимуляции ольфакторного эпителия одорантом на фоне ее ингибитора – 2,5-дидеоксиаденозина (10 мкМ). При этом флуоресцентный сигнал под действием камфоры усиливался так же, как при действии одорантом на нативный препарат (n=5), но максимального значения достигал за 5 – 6 с и дольше возвращался к исходному уровню (рис.21). Это указывает на то, что в инициации реакции на камфору аденилатциклаза не участвует, но она может влиять на её кинетику.

Для выяснения роли цАМФ в механизме трансдукции камфоры мы применяли 100 мкМ раствор кофеина, который в данной концентрации ингибирует фосфодиэстеразу, в результате чего повышается содержание цАМФ в цитозоле. Мы предположили, что если в реакции на камфору участвует циклический аденозинмонофосфат, то на фоне кофеина реакции на стимул не будет.

Однако после пятиминутной инкубации обонятельной выстилки в 100 мкМ кофеине (n=5) обдувание ее камфорой усиливало желто-зеленое свечение (рис. 22). При этом амплитуда сигнала на 134 отн.ед. превышала уровень исходного сигнала, время достижения пикового уровня сокращалось до 3,6 с, а прекращалась реакция через 19 с. Таким образом, цАМФ не участвует в инициации реакции на камфору, но повышение его цитозольного содержания за счет ингибирования ФДЭ ускоряло ответ препарата на камфору, то есть оказывало влияние на кинетику реакции.

Таким образом, аденилатциклазный путь трансдукции сигнала не участвтует в механизме восприятия камфоры. Мы предположили, что им может быть фосфоинозитидный путь. Для подтверждения нашего предположения мы исследовали участие ПКС в реакции обонятельных клеток на камфору. Она является одним из основных ферментов этого пути передачи сигнала в клетках. Опыты проводили следующим образом. Обонятельную выстилку обрабатывали Н-7 (50 мкМ), а затем стимулировали одорантом.

Из данных, представленных на рис. 23, видно, что под действием камфоры на препарат, обработанный 50 мкМ раствором Н-7, ингибирующим ПКС, интенсивность флуоресценции комплекса: Са²⁺-ХТЦ-КМ усиливалась (n=7). Максимальное значение реакции было таким же, как в нативном препарате, но она не возвращалась к исходному уровню даже в течение 1 минуты. Следовательно, без протеинкиназы С одорант способен инициировать изменение свечения, а фермент, вероятно, участвует в завершении ответа на камфору.

Если обонятельную выстилку инкубировали в рутениевом красном (30 мкМ), а затем на его фоне стимулировали камфорой (n=14), то реакция на одорант не регистрировалась (рис. 24). Рутениевый красный в клеточных и тканевых препаратах блокирует 1,4,5-трифосфоинозитид-регулируемые Са²⁺-каналы плазмолеммы, а не внутриклеточных депо, поскольку не проникает через нее в цитозоль. Отсутствие реакции на камфору после обработки обонятельной выстилки этим блокатором свидетельствует о том, что увеличение кальций-аккумулирующей способности мембран обонятельных клеток при их обдувании камфорой обусловливается, по-видимому, изменением проницаемости плазматической мембраны для Са²⁺, и этот процесс регулируется IP₃.

На рис. 25 представлены результаты исследования участия ГТФ-связывающего белка в реакции на камфору. Для этого обонятельную выстилку обрабатывали AlF₄^- и регистрировали реакцию на него. Оказалось, под воздействием фторалюмината (n=5) интенсивность флуоресценции не изменялась (рис. 25), тогда как при обдувании обонятельной выстилки камфорой в его присутствии в среде (рис. 26) она усиливалась так же, как и без него. Следовательно, активация G-белка посредством AlF₄^- не инициировала реакцию в обонятельных клетках, подобную той, которую вызывала в них камфора, и не влияла на параметры, характерные для ответа на камфору. Такой результат свидетельствует о том, что воздействие камфорой на обонятельные клетки не опосредуется ГТФ-связывающим протеином.

Однако известно, что активироватьт эффекторные белки в цепи передачи сигнала могут не только G-белки, но и тирозинкиназы. Вовлечение их в рецепцию камфоры исследовали с помощью их ингибитора 100 мкМ раствора генистейна (n=6). Для этого препарат сначала инкубировали в генистейне, а затем стимулировали камфорой. Оказалось, что при выключении этого фермента реакция на камфору не регистрировалась (рис. 27). Следовательно, способность клеточных мембран обонятельных клеток аккумулировать кальций под влиянием камфоры зависит от активности тирозинкиназ.

Таким образом, из полученных результатов видно, что в рецепцию камфоры включается фосфоинозитидная сигнальная система, сопряженная с функционированием тирозинкиназы.

3.1.3. Исследование компонентов сигнальных систем,
участвующих в рецепции цинеола

При стимуляции обонятельной выстилки цинеолом, имеющего запах душистого эвкалипта, интенсивность флуоресценции усиливалась (n=38), что связано с повышением кальций-аккумулирующей способности мембран обонятельных клеток. Усиление сигнала достигало 100 отн. ед. (рис. 28 а), его максимальное значение устанавливалось через 10 с, а через 15 – 20 с он снижался, но не возвращался к исходному уровню даже спустя минуту после своего начала. Эту особенность реагирования обонятельного эпителия на цинеол отмечали и другие авторы (Dione, 1998; Reisert, Matthews, 1998). Регистрируя электрические ответы одиночных клеток, они показали, что реакция на цинеол длится и после того, как стимуляция прекращалась.

С флуоресцентной реакций на цинеол коррелирует изменение ЭОГ (рис. 28 б). При сопоставлении продолжительности светового и электрического сигналов видно, что они совпадали и длились около 20 с. Этот факт позволяет предположить, что изменения интенсивности флуоресценции комплекса: Са²⁺ХТЦ-КМ, как и динамики ЭОГ, обусловливаются реагированием рецепторных клеток на стимуляцию цинеолм.

Роль ионов кальция из внеклеточной среды мы выявляли с помощью ЭГТА. Данные представлены на рис. 29. Видно, что на фоне ЭГТА (2 мМ) уровень светового сигнала под воздействием цинеола (n=17) не изменялся, что свидетельствует об участии внеклеточного кальция в реакции на цинеол (рис. 29).

Участие циклонуклеотид-зависимых кальциевых каналов в рецепции цинеола мы исследовали посредством дилтиазема. Как показали реультаты, после пятиминутной инкубации ольфакторного эпителия в 100 мкМ растворе дилтиазема (n=17) обдувание препарата цинеолом не изменяло уровень светового сигнала по сравнению с исходным (рис. 30). Дилтиазем, как известно, блокирует Са²⁺каналы, зависимые от циклических нуклеотидов. Следовательно, усиление кальций-аккумулирующей способности клеточных мембран в ответ на цинеол обусловливалось входом ионов кальция из внеклеточной среды в цитозоль через цАМФ-зависимые каналы.

Чтобы определить, активируется ли аденилатциклаза под действием цинеола, мы ингибировали ее с помощью 2,5,-дидеоксиаденозина (10 мкМ), которым обрабатывали препарат перед стимуляцией одорантом (n=10). Как показали результаты наших исследований, при действии цинеолом на фоне заингибированной аденилатциклазы флуоресценция комплекса: Са²⁺-ХТЦ-КМ не изменялась (рис. 31). Это означает, что кальцийсвязывающая способность мембран обонятельных клеток зависит от активности аденилатциклазы.

Цинеол вместе с камфорой входят в одну группу химических соединений и обладают сходным влиянием на некоторые клеточные процессы (Abrahim et al., 2000). Поэтому мы предположили, что в рецепции этого одоранта, как и камфоры, могут участвовать тирозинкиназы. Для доказательства данного предположения обонятельную выстилку обрабатывали 100 мкМ раствором генистейна, а затем стимулировали одорантом. При действии на препарат цинеолом на его фоне (n=12) интенсивность свечения не менялась (рис. 32). Очевидно, в реакцию на цинеол вовлекается тирозинкиназа.

Таким образом, результаты исследования позволяют сделать вывод о том, что рецепция цинеола осуществляется с участием системы цАМФ, причем этот вторичный мессенджер синтезируется благодаря активации аденилатциклазы, сопряженной с тирозинкиназой.

3.1.4. Исследование компонентов сигнальных систем
обонятельных клеток, участвующих в рецепции амилацетата

Стимуляция обонятельной выстилки амилацетатом, обладающим фруктовым ароматом (n=31), приводила к усилению флуоресценции (рис. 33). Амплитуда ответа в среднем на 64 отн. ед. превышала исходный уровень и достигала его через 6,2 с, а через 16,9 с сигнал возвращался к исходному уровню. Следовательно, амилацетат увеличивает кальций-аккумулирующую способность клеточных мембран обонятельных клеток.

На рис. 34 представлены данные, в которых реакция на стимул (n=6) регистрировалась при наличии в среде 2 мМ раствора ЭГТА. Как оказалось, при удалении кальция из омывающего раствора реакция на одорант исчезала. Следовательно, в ответ на стимуляцию амилацетатом вовлекается внеклеточный кальций.

Для выявления участия аденилатциклазы в реакции на амилацетат обонятельную выстилку обрабатывали 2,5-дидеоксиаденозином (n=12), и на этом фоне обдували амилацетатом. Как видно из рис. 35, реакции на стимуляцию амилацетатом не было. Таким образом, ингибирование аденилатциклазы приводило к исчезновению ответа на одорант. Это означает, что рост кальций-аккумулирующей способности мембран обонятельных клеток при обдувании амилацетатом обусловливается активностью аденилатциклазы.

Для выявления возможной роли G-белка в генерации Са²⁺-сигналов, индуцированных амилацетатом, обонятельную выстилку обрабатывали фторалюминатом (AlF₄^-) и регистрировали реакцию на него, а также на одорант в его присутствии (n=11). Чтобы получить фторалюминат, на препарат апплицировали 50 мкМ раствора хлористого алюминия и 10 мМ раствора фтористого натрия. Данные, представленные на рис. 36, показывают, что добавление смеси этих солей вызывало повышение интенсивности флуоресценции, сходное с действием одоранта. Подобие реакций, возникающих на стимуляцию пахучим веществом и AlF₄^-, свидетельствует, очевидно, об аналогии механизмов их влияния на люминесценцию. Усиление интенсивности флуоресценции комплекса: Са²⁺-ХТЦ-КМ под действием амилацетата можно объяснить активацией G-белка.

На стимуляцию амилацетатом на фоне AlF₄^- (n=11) в 64% случаев обонятельные клетки не реагировали (рис. 37), а в 36% их ответ был значительно снижен. Эти данные можно объяснить, вероятно, насыщением системы трансдукции, вызванным активацией одного из ее компонентов – ГТФ-связывающего белка, в результате чего блокируется вход Са²⁺ в цитозоль, а это служит еще одним свидетельством в пользу того, что повышение интенсивности флуоресценции в ответ на амилацетат обусловливается активацией G-белка.

Как было нами показано, в реакции на амилацетат участвует внеклеточный кальций. Вход его в клетку из окружающей среды возможен только через Са²⁺-каналы в плазмолемме. Их участие мы исследовали с помощью дилтиазема – блокатора Са²⁺-каналов, открываемых цАМФ. На рис. 38 приведены результаты влияния блокирования циклонуклеотид-регилируемых Са⁺-каналов (n=6) на динамику флуоресценции, индуцируемой амилацетатом в обонятельных клетках. Видно, что блокирование пути входа кальция полностью подавляло ответ на одорант. Следовательно, интенсивность флуоресценции комплекса: Са²⁺-ХТЦ-КМ усиливалась под действием амилацетата благодаря входу ионов кальция через каналы, регулируемые цАМФ.

Вместе с тем известно, что ионные каналы могут регулироваться протеинкиназами. Чтобы проверить предположение об участии в реакции на амилацетат прортеинкиназы А, обонятельную выстилку инкубировали в Н-7 – ингибиторе ПКА и ПКС. Оказалось, что если выключить эти ферменты и стимулировать обонятельную выстилку амилацетатом (n=7), то реакция на стимул такая же, как и без Н-7 (Рис. 39). Это свидетельствует о том, что изменение флуоресценции, индуцируемое амилацетатом, не обусловливается активацией протеинкиназы А. Следовательно, не с этим ферментом связано открывание Са²⁺-каналов в плазмолемме обонятельных жгутиков под действием амилацетата.

Таким образом, из полученных результатов можно заключить, что амилацетат, обладающий фруктовым запахом, вовлекает в реакцию систему цАМФ, сопряженную с активацией аденилатциклазы и G-белка.

3.1.5. Исследование компонентов сигнальных систем
обонятельных клеток, участвующих в рецепции ванилина

На рис. 40 а представлены данные по изменению флуоресценции комплекса: Са²⁺-ХТЦ-КМ при стимуляции обонятельной выстилки ванилином, обладающим цветочным запахом. Видно, что в ответ на одорант интенсивность свечения увеличивалась (n=38). Амплитуда сигнала примерно через 20 с достигала 100 отн. ед., а затем свечение угасало, возвращаясь к исходному уровню через 40 с. С этим ответом коррелировала ЭОГ (рис. 40 б).

Под действием одоранта на фоне 2 мМ раствора ЭГТА (n=10) реакция на ванилин исчезала (рис. 41), что свидетельствует об участии внеклеточного кальция в инициации ответа на ванилин.

Роль аденилатциклазы в усилении светового сигнала, возникающего под действием одоранта, изучали с помощью ингибитора этого фермента – 2,5-дидеоксиаденозина (n=10). Из данных, представленных на рис. 42, видно, что при ингибировании фермента реакция на ванилин сохранялась. Следовательно, повышение флуоресценции комплекса: Са²⁺-ХТЦ-КМ обонятельных клеток не обусловливается активацией аденилатциклазы.

Мы предположили, что в реакцию на этот одорант может вовлекаться фосфоинозитидный путь. Чтобы проверить это предположение, обонятельную выстилку в течение 5 – 7 минут инкубировали в неомицине, а затем обдували ванилином (n=6). Оказалось, что ингибирование фосфолипазы С, основного фермента фосфоинозитидной сигнальной системы, полностью подавляло одорант-индуцируемое повышение интенсивности флуоресценции (рис. 43). Это означает, что изменение светового сигнала, иницируемое ванилином, связано с активацией ФЛС.

Фосфолипаза С, как известно, может стимулироваться сопряженным с ней G-белком. Чтобы проверить такой вариант объяснения механизма активации фосфолипазы С в исследуемых рецепторах, мы апплицировали на обонятельную выстилку смесь 50 мкМ раствора AlCl₃ и 10 мМ раствора NaF (n=6) и регистрировали реакцию на воздействие этой смеси. Данные, представленные на рис. 44, показывают, что фторалюминат вызывал повышение флуоресценции комплекса: Са²⁺-ХТЦ-КМ, подобное индуцированному одорантом, но длящееся значительно дольше. Сходство реакций свидетельствует об участии ГТФ-связывающего белка в инициации ответа на ванилин. В то же время стимуляция обонятельной выстилки ванилином на фоне фтористого алюминия приводит к значительному или даже полному подавлению ответа обонятельных клеток на ванилин (рис. 45), что связано с насыщением системы трансдукции и полным прекращением входа кальция в клетки (Крутецкая и др., 2003). Это подавляющее влияние на флуоресцентный сигнал является дополнительным доказательством участия ГТФ-связывающего белка в реакции на ванилин.

Известно, что в невозбудимых клетках, к которым относятся обонятельные, кальций входит по лиганд-управляемым каналам. Мы предположили, что ими могут быть каналы, управляемые IP₃, так как ключевым ферментом в реакции с ванилином является фосфолипаза С, гидролизующая мембранные фосфолипиды, повышая содержание IP₃ в клетке. На рис. 46 представлены результаты, полученные при обдувании обонятельной выстилки ванилином на фоне рутениевого красного (n=10), который блокирует Са²⁺-каналы в плазмолемме, открываемые 1,4,5-трифосфоинозитидом. Видно, что на фоне блокатора Са²⁺-каналов реакция на ванилин полностью исчезала. Это означает, что усиление интенсивности флуоресценции комплекса: Са²⁺-ХТЦ-КМ, связанное со стимуляцией одорантом, обусловливалось входом ионов кальция по каналам, регулируемым IP₃.

Участие протеинкиназы С в реакции на ванилин мы исследовали с помощью соединения Н-7 (n=6). Для этого обонятельную выстилку инкубировали в течение 5 – 7 минут в Н-7, а затем стимулировали ванилином. На рис. 47 показано, что ингибирование протеинкиназы С не влияло на усиление флуоресценции, индуцируемое одорантом. Следовательно, кальций-аккумулирующая способность мембран обонятельных клеток не зависит от активности этого фермента.

Таким образом, в реакции обонятельной выстилки на ванилин участвует фосфоинозитидная сигнальная система. Синтез IP₃ для его участия в качестве вторичного посредника реакций обонятельных рецепторов на ванилин катализируется фосфолипазой С, активируемой G-белком.

Следует отметить, что амиловый спирт, обладающий прогорклым запахом, камфору – камфорным, цинеол – эвкалиптовым, амилацетат, имеющий фруктовый запах, и ванилин, обладающий цветочным ароматом, мы включили в первую группу одорантов.