2015-06-10
814
Для выявления компонентов внутриклеточных сигнальных систем, участвующих в обонятельной рецепции различных одорантов, мы использовали ингибиторный и активаторный анализ. В экспериментах были использованы реактивы фирмы Sigma и ICN Biomedicals Inc.
Иономицин (1 мкМ) – кальциевый ионофор, опустошающий внутриклеточные кальциевые депо, не чувствительные к IP3. Мы использовали его в качестве имитатора фосфоинозитидного пути трансдукции, поскольку он повышает концентрацию цитозольного кальция, посредством чего активируется протеинкиназа С – один из ключевых ферментов этого пути (Авдонин, Ткачук, 1994).
Н-7 (50 мкМ) – сильный ингибитор протеинкиназы С и циклонуклеотид-зависимых протеинкиназ. Отсутствие реакции на стимул на его фоне свидетельствует об участии этих киназ в ней.
Дилтиазем (10 мкМ) и нифедипин (50 мкМ) – специфические ингибиторы циклонуклеотид-зависисимых Са2+-каналов. После инкубации препарата в растворе одного из реактивов ответ на раздражитель исчезает, если он обусловлен входом ионов кальция через каналы, регулируемые циклическими нуклеотидами.
Форсколин (10 мкМ) является универсальным активатором аденилатциклазы в различных типах клеток. Полагают, что он прямо взаимодействует с каталитической субъединицей аденилатциклазы, активируя ее более, чем в три раза в обонятельных рецепторах крыс (Iorgenko, Levin, 2000). Форсколин вызывает реакцию, подобную действию изучаемого стимула, но на его фоне подавляется рецепторзависимое увеличение внутриклеточного содержания Са2+ (Авдонин, Ткачук, 1994).
Тапсигаргин (100 нМ) – это ингибитор Са2+-АТФазы эндоплазматического ретикулума. Вызывает пассивную мобилизацию Са2+ из внутриклеточных депо независимо от активации рецепторов и генерации специфических инозитолфосфатов. Его применяют для прямого исследования емкостного входа Са2+ (Крутецкая, Лебедев, 1998). Возникновение реакции под действием тапсигаргина, сходной с таковой под влиянием тестируемого раздражителя свидетельствует о том, что вход Са2+ в клетку обусловлен опустошением кальциевых депо.
Кофеин использовали в двух концентрациях. 10 мМ раствор этого вещества опустошал внутриклеточные депо за счет кофеин-индуцированного высвобождения кальция (Ganitkevich, Isenberg, 1992; Drummond et al., 2000), а в концентрации 100 мкМ он ингибировал фосфодиэстеразу. При этом повышалось цитозольное содержание циклического аденозинмонофосфата. Если регистрируется реакция, имитирующая действие стимула, а на фоне кофеина она снижается, то это означает, что механизм его действия опосредуется цАМФ (Lancet, 1987).
Участие в активации системы цАМФ исследовали также с помощью 2,5- дидеоксиаденозина (10 мкМ) – ингибитора аденилатциклазы. После инкубирования в нем препарата ответ на стимул не регистрировался, если он возникал в результате активации этого фермента.
Рутениевый красный (30 мкМ) является неконкурентным ингибитором 1,4,5-трифосфоинозитид-регулируемых каналов (Cadiou et al., 1997; White, Reynolds, 1997; Ma, Michel, 1998). Он почти не проникает через мембрану, поэтому его использовали для изучения этих каналов, локализованных в плазмолемме (Rizzuto et al., 2000).
Генистейн (100мкМ) ингибирует тирозин-специфические протеинкиназы (Akiyama et al., 1987).
Для исследования участия ГТФ-связывающего белка (G-белка) в реакциях на одоранты мы применяли фтористый алюминий, с помощью которого достигается лиганднезависимая активация этого протеина. AlF4- имитирует реакцию, если в ней участвует G-белок.
FCCP (5 мкМ) является классическим протонофором, разобщающим окислительное фосфорилирование. Он снижает градиент рН на внутренней мембране митохондрий, деполяризует митохондрии и ускоряет транспорт электронов по дыхательной цепи. Он быстро и обратимо блокирует митохондриальный захват Са2+, а при определенных условиях приводит к ингибированию Са2+-АТФазы (White, Reynolds, 1997). С его помощью обнаруживается изменение кальций-аккумулирующей способности мембран, связанное с выходом Са2+ из митохондрий и его зависимость от уровня их энергизации.
Ротенон (1 мМ) – специфический ингибитор НАДН-дегидрогеназного участка дыхательной цепи. Подавляет дыхание клеток и тканей, восстанавливает пиридиннуклеотиды, сильно блокирует окисление ФП, ингибируя НАДН-дегидрогеназу (Лукьянова и др., 1982, O` Rourke, 2000). Анализ ротенон-чувствительной компоненты дыхания препаратов позволяет получить информацию об относительном вкладе НАД-зависимого окисления. А это, в свою очередь, позволяет судить о направлении метаболического потока в клетке.
Азид натрия (1 мМ) представляет собой ингибитор терминального участка электрон-транспортной цепи. Способен блокировать перенос электронов на цитохром с оксидазу. Он подавляет дыхание, активный транспорт ионов, восстанавливает переносчики электронов дыхательной цепи митохондрий.
Маточные растворы тапсигаргина (500 мкМ), 1-(5-изохинолин сульфонил)-2 метил пиперазина (Н-7) (50 мМ), генистейна (100 мМ), нифедипина (20 мМ), форсколина (10 мМ), 2,5-дидеоксиаденозина (10 мМ) готовили в диметилсульфоксиде (DMSO). Маточные растворы кофеина (10 мМ), фтористого натрия (5 М), хлорида алюминия (20 мМ), рутениевого красного (1,5 мМ), ХТЦ (1,5 мМ), ЭГТА (2 мМ), неомицина (20 мМ), дильтиазема (10 мМ) готовили на дистиллированной воде. Маточные растворы одорантов камфоры, ванилина, амилацетата, цинеола (1 М) готовили в DMSO. Аммиак – 10% нашатырный спирт.
Глава 3. Результаты исследований
