Исследование влияния одорантов на митохондриальное дыханине обонятельных клеток

Придя на основании косвенных данных к выводу о вовлечении митохондрий обонятельных клеток в реакции на одоранты, мы приступили к исследованию этого вопроса в опытах с непосредственной регистрацией параметров клеточного дыхания.

Уровень функциональной активности клеток тесно коррелирует с интенсивностью их дыхания. Многие раздражители, как физические, так и химические, стимулируют митохондриальные ферменты, усиливают окислительное фосфорилирование и таким образом активируют клеточное дыхание.

Влияние одорантов на активность дыхательной цепи митохондрий мы исследовали посредством анализа собственной флуоресценции восстановленного никотинамидадениндинуклеотида (НАДН) и окисленных флавопротеидов (ФП) в митохондриях обонятельных клетках.

Для ответа на вопрос – прямо или опосредованно пахучие вещества влияют на дыхание митохондрий, ингибировали аденилатциклазу или фосфолипазу С (ключевые ферменты цАМФ и фосфоинозитидной сигнальных систем, соответственно), а затем анализировали реакции на стимулирование обонятельной выстилки одорантами.

3.2.1. Исследование влияния амилового спирта на активность
дыхательной цепи митохондрий обонятельных клеток

При стимуляции обонятельной выстилки амиловым спиртом из 13 опытов в 91% случаев интенсивность синего свечения усиливалась в среднем на 17%, доходя до максимума за 29 с и снижаясь до исходного значения через 98 с (рис. 59 а). Увеличение светового сигнала в синей области спектра связано с повышением содержания в митохондриях НАДН. Следовательно, стимуляция обонятельной выстилки амиловым спиртом повышала митохондриальный пул НАДН.

Интенсивность желто-зеленой флуоресценции под действием амилового спирта изменялась по-разному. В 33% опытов одорант инициировал снижение уровня свечения на 23%. Такое изменение собственной флуоресценции указывает на преобладание восстановленных форм ФП, которые при этом теряют способность флуоресцировать. Однако в большинстве случаев сигнал усиливался в среднем на 4,2% (рис. 59 б). Своего пикового значения реакция достигала через 16 с, и длилась в течение 62 с. Следовательно, под действием амилового спирта соотношение окисленных и восстановленных форм флавопротеидов в рецепторных клетках сдвигается в сторону повышения окисленных.

Изменение митохондриального пула НАДН и флавопротеидов может свидетельствовать о том, что амиловый спирт влияет на окислительно-восстановительное состояние дыхательной цепи митохондрий в обонятельных клетках.

Как видно, реакция на амиловый спирт длится 60 с, мы предположили, что это может быть обусловлено не прямым действием одоранта на митохондрии, а опосредовано сигнальными системами. Для проверки этого предположения мы стимулировали обонятельную выстилку амиловым спиртом на фоне 2,5-дидеоксиаденозина, специфического ингибитора аденилатциклазы, принимающей участие в реакции на амиловый спирт.

Оказалось, что на фоне ингибирования аденилатциклазы в шести из семи опытов амиловый спирт усиливал собственную флуоресценцию НАДН не на 17%, а на 13%.Реакция достигала максимального уровня через 27 с, а её длительность составляла 102 с. Как видно, ингибирование аденилатциклазы ослабляло вызываемое одорантом усиление синего свечения. Возможно, такой эффект можно объяснить уменьшением пула восстановленных пиридиннуклеотидов в митохондриях обонятельных клеток, обусловленное ингибированием активности аденилатциклазы. Этот вывод подтверждается также и тем, что в данных экспериментальных условиях изменялись и временные параметры реакции – укорачивалось время до максимального значения и удлинялось течение реакции.

Стимуляция обонятельной выстилки амиловым спиртом в присутствии 2,5-дидеоксиаденозина в 43% случаев вызывала усиление желто-зеленого свечения до 17%, что почти в 4 раза выше, чем в нативном препарате. Следовательно, ингибирование фермента существенно повышало содержание окисленных ФП. При этом ускорялся выход сигнала на максимальный уровень, и это время составляло 13 с, а длительность ответа увеличивалась на 11 с. Однако в 42% опытов одорант вообще не инициировал изменение собственной флуоресценции флавопротеидов. Это означает, что ингибирование аденилатциклазы прекращало реакцию ФП на одорант.

Таким образом, реакции дыхательной цепи митохондрий на амиловый спирт на фоне ингибирования АЦ снижались и даже исчезали, что может свидетельствовать о том, что изменения окислительно-восстановительного состояния митохондриальных НАДН и ФП обонятельных клеток опосредуются через аденилатциклазный путь трансдукции.

3.2.2. Исследование влияния камфоры на активность
дыхательной цепи митохондрий обонятельных клеток

При стимуляции обонятельной выстилки камфорой в 4 опытах из 13 интенсивность синего свечения снижалась в среднем на 8,3%. Этот факт можно, очевидно, объяснить повышением содержания НАД+ в митохондриях обонятельных клеток. Однако в 54% экспериментов интенсивность собственной флуоресценции НАДН на 7,7% усиливалась (рис. 60 а), что свидетельствует об увеличении митохондриального пула восстановленных пиридиннуклеотидов. Следовательно, можно предположить, что в результате воздействия камфорой на обонятельные клетки НАД+ в их митохондриях восстанавливается.

Из данных, представленных на рис.60 б, видно, что стимуляция камфорой в 40% опытов приводила к увеличению на 23,7% желто-зеленого свечения, которое связано с повышением содержания окисленных форм флавопротеидов. Однако в 46% случаев интенсивность собственной флуоресценции ФП на 11,1% снижалась, то есть увеличивалось содержание восстановленных флавопротеидов.

Таким образом, результаты наблюдений позволяют заключть, что камфора изменяла окислительно-восстановительное состояние переносчиков электронов в дыхательной цепи митохондрий обонятельных клеток.

Чтобы ответить на вопрос о том, прямо или опосредованно камфора изменяет окислительно-восстановительное состояние никотинамидадениндинуклеотидов и флавопротеидов, мы ингибировали фосфолипазу С (n=6), которая является основным ферментом фосфоинозитидного пути. Для этого препарат инкубировали в неомицине, а затем стимулировали одорантом.

В результате оказалось, что в 67% опытов камфора не инициировала изменений интенсивности собственной флуоресценции НАДН. В то же время интенсивность желто-зеленого свечения в 67% опытов увеличивалась на 13%, то есть в 2 раза меньше, чем одорант-зависимый ответ в нативном препарате. Следовательно, в подавляющем числе опытов выключение фосфолипазы С приводило к исчезновению индуцированного одорантом повышения НАДН и вдвое уменьшало реакцию окисленных ФП. Таким образом, без ФЛС окислительно-восстановительные процессы, вызываемые камфорой, прекращаются или резко снижаются.

На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что в действие камфоры на активность дыхательной цепи митохондрий вовлекается фосфоинозитидная сигнальная система.