Проведение исследований

Бактериологическое исследование молока (секрета) проводят сразу после доставки его в лабораторию. Оставшееся молоко хранят при температуре не выше 6°С.

Посев молока (секрета) проводят на мясо-пептонный агар с цитратной кровью крупного рогатого скота или дефибринированной кровью барана (рецепт 1) и дифференциально-диагностические или элективные среды.

Для идентификации выросших культур микроорганизмов учитывают характер роста колоний и вид гемолиза на кровяном МПА, проводят микроскопию мазков, сделанных из одинаковых по морфологическим свойствам колоний и окрашенных по Грамму, изучают культурально-би­охимические свойства.

а) Выделение золотистого стафилококка

Рост на кровяном МПА. Колонии средние и крупные, выпуклые с гладкой или шероховатой поверхностью, ровными краями, золотистого цвета.

Образуют зону гемолиза.

α-гемолиз - зона прозрачная вокруг колонии; β-гемолиз - зона непрозрачная (матовая.), лучше проявля­ется при выдержке посевов в холодильнике при температуре 5-8°С в течение 24 ч; α и β гемолиз смешанный.

При микроскопии имеют шарообразную форму и располагаются в виде гроздевидных скоплений, тетрами или одиночно. По Грамму кра­сятся положительно.

ДНК-азная активность. Выделение золотистого стафилококка ус­коренным методом и определение ДНК-азной активности проводят с использованием элективной, дифференциально-диагностической среды ДНК-новокаинового агара (рецепт 2).

Элективные свойства среды обусловлены ингибирующим действием на постороннюю микрофлору новокаина, дифференцирующие - наличием ДНК, позволяющей идентифицировать золотистый стафилококк по его дезоксирибонуклеазной активности.

Готовят разведение исследуемых проб молока, (секрета) на сте­рильном физиологическом растворе 1:10 и 1:100. В чашку Петри с ДНК-новокаиновым агаром вносят 0,1 мл молока (секрета) в разведе­нии 1:100 и равномерно распределяют стерильным стеклянным шпате­лем по всей поверхности питательной среды. Засеянные чашки поме­щают в термостат крышками вниз и инкубируют при 37-38°С в течение 22-24 ч. Для выделения ДНК-азной активности золотистого стафило­кокка поверхность среды в чашках с выросшими культурами заливают 5-7 мл 1н раствора соляной кислоты. Чашки с кислотой выдерживают 2-3 мин, затем кислоту сливают и учитывают результаты, просматри­вая чашки в проходящем свете.

При выделении культуры стафилококка на кровяном агаре и на­личии изолированной чистой культуры ДНК-азная активность может быть определена путем посева на ДНК-агар (рецепт 3).

На ДНК-новокаиновом агаре золотистый, стафилококк растет в виде крупных круглых колоний с ровными краями, окруженных зоной просветления с четкими границами.

Для определения количества золотистого стафилококка в 1 мл исследуемого молока (секрета) подсчитывают колонии с зоной прос­ветления по всей поверхности среды и полученное число колоний ум­ножают на 10 (брали 0,1 мл материала) и на 100 (степень разведения).

Каталазная активность. На предметное стекло наносят каплю 10% перекиси водорода и в ней растирают внесенную бактериологи­ческой петлей чистую культуру микроорганизмов.

При положительной реакции на каталазу происходит интенсивное газообразование которое проявляется вспениванием капли перекиси водорода. Фермент каталазу содержат стафилококки и микрококки.

Реакция плазмокоагуляции (РПК). Культуру стафилококка высе­вают в пробирки с мясо-пептонным бульоном и через 3 ч после выращивания в термостате при температуре 37°С используют для поста­новки РПК с цельной или сухой плазмой крови кролика. Для этого плазму разводят стерильным физиологическим раствором в соотноше­нии 1:5 и разливают в аглютинационные пробирки по 0,5 мл. Бульонную культуру стафилококка по 0,1 мл (2 капли) вносят в пробирки с разведенной кроличьей плазмой. Для контроля в одну пробирку с плазмой не вносят культуру, а в другую засевают заведомо плазмо-аглютинирующий стафилококк. Пробирки помещают в термостат при температуре 37°С и через каждый час в течение 3ч, 18 и 24 ч учитывают результаты.

При положительной реакции РПК образуется сгусток, который не выпадает из пробирки при наклоне или плавает в плазме.

Золотистый стафилококк является плазмокоагулируюшим.

Ферментация манита в анаэробных условиях. Суточную бульонную культуру стафилококка в количестве 0,2 мл (3-4 капли) высевают в пробирку с 0,15% полужидким агаром, содержащим 0,15% манита и индикатор Андраде, под вазелиновым маслом (рецепт 4). Посевы инкубируют в термостате при температуре 37°С. Результаты учитывают через каждые 24 ч, а окончательный результат - через 5 сут.

Появление розового окрашивания (изменение цвета индикатора) указывает на ферментацию манита в анаэробных условиях, что является дифференцирующим признаком для золотистого стафилококка.

б) Выделение стрептококков

Рост на 5% кровяном МПА. Колонии мелкие, росинчатые, образу­ют зону гемолиза α и β, смешанную или она отсутствует.

При микроскопии имеют шарообразную, бобовидную форму и рас­полагаются в виде коротких или длинных цепочек.

Рост на среде Карташовой (рецепт 5). В пробирку со средой вносят 1 мл исследуемого молока или пересевают выросшие на кровя­ном агаре росинчатые колонии и инкубируют в термостате при темпе­ратуре 37°С в течение 18-24 ч.

Из пробирок с измененным цветом среды делаютмазки, окраши­вают по Грамму и проводят микроскопию на предмет обнаружения стрептококков.

Каталазная активность. Проводится аналогично как для стафилококков.

Стрептококки не содержат фермент каталазу, поэтому с пере­кисью водорода дают каталазоотрицательную реакцию.

Устойчивость к желчи. Предварительно культуру стрептококков выращивают в мясо-пептонном бульоне (МПБ) с I% глюкозы (рецепт 6), а затем вносят 1 мл культуры в пробирки с 5 мл МПБ, содержа­щего 40% желчи (рецепт 7) и ставят в термостат при температуре 37°С на 24 ч.

Полное просветление бульона указывает на лизис культуры, по­мутнение - на рост.

Рост в МПБ с рН 9,б. 1мл бульонной культуры стрептококков, выращенных на МПБ с глюкозой (рецепт 6), вносят в пробирку с 5 мл МПБ и рН 9,6, инкубируют в термостате при температуре 37°С в те­чение 24 ч.

Обесцвечивание среды указывает на наличие роста стрептокок­ков, восстанавливающих своими окислительно-восстановительными ферментами метиленовый синий.

Этим свойствам обладают стрептококки серологических групп D и N. (по Ленсфильд).

КАМП-тест. Основан на том, что стрептококки групп В при вы­ращивании на кровяном агаре, содержащем стафилококковый β-токсин, образуют дополнительную, ясно выраженную зону гемолиза эритроци­тов барана, крупного рогатого скота.

Суточную бульонную культуру β-гемолитического стафилококка высевают на 5% кровяной агар сплошной линией по диаметру чашки Петри. Перпендикулярно к линии посева стафилококка, не доходя 5-6 мм, высевают ровным штрихом испытуемую культуру стрептококков. На одной чашке можно проверить 8-10 культур.

КАМП-тест считают положительным, если четко выражена зона гемолиза испытуемого стрептококка в виде усеченного треугольника или полукруга в зоне β-гемолитического стафилококка. Наиболее ярко эта зона проявляется после выдержки чашек в холодильнике в те­чение 18-84.

в) Выделение бактерий группы кишечной палочки (БГКП).

Образцы молока или колоний с кровяного агара, морфологичес­кие свойства которых напоминают БРКП, высевают на среду КОДа (ре­цепт 9) и помешают в термостат при температуре 35°С на 24 ч.

Изменение цвета среды из фиолетового в зеленый свидетельст­вует о наличии ВГКП.

Идентификацию эшерихий, бактерий рода энтеробактер от сальмонелл и протея проводят на среде Олькеницкого (рецепт 10). Со среды КОДа зеленого цвета посев на среду Олькеницкого в пробирках проводят бактериологической петлей на поверхность скоса среды и внутрь столбика. Посевы инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 24 ч.

Изменение цвета (глюкоза+, лактоза+) скоса и столбика среды из красного в желтый при отсутствии почернения внутри свидетель­ствует о росте бактерий группы эшерихий.

Изменение скоса среды и столбика в малиновый цвет (мочевина+) и почернение внутри столбика (сероводород+) указывает на рост протея.

Изменение скоса в красный, столбика в желтый и почернение внутри столбика указывает на рост сальмонелл.

г) Выделение синегнойной палочки.

Бактерии этой группы при росте на питательных средах выраба­тывают сине-зеленый пигмент - пиоцианин за счет которого проис­ходит окрашивание этих сред.

Образцы молока или колоний с кровяного агара, при микроскопии которых обнаружены грамотрицательные палочки, высевают на МПА и МПБ, культивируют в термостате при температуре 37°С в течение 24-48 ч, дополнительно до 72 ч.

Появление сине-зеленого окрашивания МПБ и МПА, роста гладких плоских колоний с ровными или изрезанными краями указывает на рост синегнойной палочки, вырабатывающей пигмент пиоционин.

Из МПБ и МПА делаютмазки, окрашивают по Грамму и просматривают под микроскопом.

При обнаружении в мазках грамотрицательных палочек и измене­нии цвета сред в сине-зеленый ставят реакцию для обнаружения пиоционина.

Определение пиоционина. В пробирку с МПБ добавляют 1млхлороформа, пробирку встряхивают.

При положительной реакции хлороформ приобретает зеленый цвет и опускается на дно пробирки.

У пигментообразующих сапрофитных бактерии в хлороформе пиг­мент не растворяется.

д) Выделение грибов рода Саndida

Пробы молока в количестве по 0,1-0,3 мл высевают на 2 чашки Петри с элективной дифференциально-диагностической средой (рецепт 11), равномерно распределяя материал по поверхности стерильным шпателем. Засеянные чашки помещают в термостат вверх дном при температуре 37°С на 18-20 ч.

Контролем служит посев культуры этого гриба на ту же самую элективную дифференциально-диагностическую среду.

После инкубации чашки Петри просматривают, из подозрительных колоний делают мазки, окрашивают их по Грамму или другими метода­ми, а также делают посев на ту же самую среду для выделения чис­той культуры и выявления псевдомицелия. Засеянные пробирки выдер­живают в термостате при температуре 37°С в течение 24ч, затем выдерживают при комнатной температуре 2 суток.

Первичный учет делают через 21-24 ч после инкубации материа­ла, а окончательный - на 4-й день исследования.

Колонии грибов рода Саndida гладкие, морщинистые, плоские, беловато-серые, кремо-беловатые, кремовые, мягкой консистенции, кожистые.

При микроскопии обнаруживают псевдомицелий, а также почкую­щиеся клетки (споры, истинный мицелий, -иногда хламидоспоры).

Схема идентификации кокковой микрофлоры молока по В.Д. Парикову, В.И. Сдободянику и др.

Пробы молока (секрета) высевают на секторы (4,8) кровяного МПА в чашках Петри, выдерживают в термостате 24 ч при температуре 37°С, учитывают характер роста и вид гемолиза. Из колоний, характерных для кокковых микроорганизмов, делают посев на секторы (8) кровяного МПА для получения чистых культур. Из других колоний де­лают мазки, красятих по Грамму и микроскопируют. Чашки Петри с отсеянными микроорганизмами инкубируют в термостате при темпера­туре 37°С 24 ч.

Выросшие чистые культуры кокковых микроорганизмов проверяют на каталазу с 3% перекисью водорода на предметном стекле, а также готовят мазки, красят по Грамму и микроскопируют. Каталазоположительные микроорганизмы относят к стафилококкам, а каталазоотрицательные - к стрептококкам.

Дифференциация стафилококков

Учет роста на кровяном МПА, вид гемолиза, микроскопию, постановку ТОК проводят как, как описано раньше.

Анаэробная ферментация манита. Среду (рецепт 12) перед применением ставят в водяную баню и кипятят 10-15мин для удаления растворенного кислорода, охлаждают до 45-50°С и вносят на дно пробирки бактериологической петлей чистую культуру стафилококка. Поверхность среды покрывают стерильным вазелиновым маслом или парафином, слоем 2 см. Пробы культивируют в термостате при темпера­туре 37°С в течение 5 дней.

Отсутствие желтого окрашивания или пожелтение только поверх­ности среды свидетельствует об отсутствии анаэробной ферментации манита.

Анаэробная ферментация глюкозы. Используют среду, приготов­ленную по рецепту 12, в котором применяют глюкозу вместо манита, и проводят исследование по аналогичной схеме.

б) Дифференциация стрептококков

Каталазоотрицательные культуры кокковых микроорганизмов про­веряют по КАМП-тесту на среде с эскулином (рецепт 13) по схемам.

Проводят по наличию просветления в зоне β-гемолиза - гемолитического стафилококка и по цвету колоний. Около 5% штаммов Str. agalactiae дают КАМП тест отрицательный и около 30% штаммов Str. uberis дают КАМП тест положительный.