Аликвоту, соответствующую 0,1 мл мочи или 0,1 г органа, хроматографируют в системах растворителей, различающихся по своей полярности:
1 - толуол-ацетон-этанол-25% аммиак, (45:45:7:3);
2 - этилацетат-абсолютный этанол-25% аммиак, (18:6:2);
3 - ацетонитрил-хлороформ-этилацетат-25% аммиак, (40:30:25:5);
4 - этанол - ледяная уксусная кислота - вода, (60:30:10).
5 – ацетон – хлороформ – 25% аммиак, (24:12:1)
Таблица 1.
Величины Rf опиатов, некоторых наркотичских и некоторых лекарственных веществ при разделении их методом ТСХ на пластинках Сорбфил ПТСХ-ПА «Силуфол»
Разделяемые соединения | Хроматографические системы | ||||
Героин | 0,53 | 0,73 | 0,41 | ||
6-МАМ | 0,48 | 0,72 | 0,30 | ||
Кодеин | 0,36 | 0,60 | 0,22 | 0,32-0,38 | |
Морфин | 0,23 | 0,34 | 0,08 | 0,10-0,15 | |
Наркотин | 0,70 | 0,86 | 0,73 | 0,45-0,50 | |
Папаверин | 0,59 | 0,81 | 0,64 | ||
Тебаин | 0,50 | 0,69 | 0,41 | ||
Ацетилкодеин | 0,55 | 0,75 | 0,44 | ||
Гидрокодон | 0,40 | 0,65 | 0,23 | ||
Промедол | 0,58 | 0,81 | 0,55 | ||
Анальгин | 0,49 | 0,75 | 0,48 | ||
Антипирин | 0,47 | 0,74 | 0,45 | ||
Делагил | 0,44 | 0,75 | 0,43 | ||
Димедрол | 0,60 | 0,85 | 0,60 | ||
Кокаин | 0,73 | 0,81 | 0,70 | ||
Кофеин | 0,49 | 0,57 | 0,48 | ||
Никотин | 0,52 | 0,80 | 0,45 | ||
норкотинин | 0,18 | 0,46 | 0,23 | ||
котинин | 0,32 | 0,71 | 0,45 | ||
Трамадол | 0,77 | 0,85 | 0,61 | ||
Эфедрин | 0,20 | 0,46 | 0,12 | ||
Длина пробега фронта растворителя 8-10 см. Пластинку сушат в потоке холодного воздуха и проявляют 0,5 % раствором феррицианида калия, содержащего несколько капель 10% раствора хлорида окисного железа. В зоне, соответствующей морфину, наблюдается синее окрашивание. Проявление следует осуществлять после использования именно 4-й системы растворителей.
|
|
При хроматографировании в щелочных и нейтральных системах морфин даёт слабо-фиолетовое окрашивание, исчезающее при стоянии. Нижний предел обнаружения 2-3 мкг морфина. Ярко-синее окрашивание дают фенолы, фенольные стероиды, триптамин и ароматические амины. Исследование соответствующей аликвоты указанным количествам мочи или органов исключает возможность проявления экстрактивных веществ.
При исследовании в данных условиях аликвот, соответствующих 4-5 мл мочи или 4-5 г органа, проявляются экстрактивные вещества с Rf =0,75 и Rf =0,45. Rf морфина – 0,1-0,15 (в 4-й системе).
Аликвоту, соответствующую 4 мл мочи или желчи (или 4 г органа), хроматографируют в системах 1-3 на пластинках «Силуфол», «Сорбфил». Длина пробега фронта растворителя 8-10 см. После хроматографирования пластинку сушат в потоке холодного воздуха и проявляют.
Реактивы проявления:
1. Реактив Драгендорфа в модификации Мунье [4]: раствор 1: 17 г азотнокислого висмута и 200,0 г винной кислоты растворяют в 800 мл воды; раствор 2: 160 г КI растворяют 400 мл воды. Растворы смешивают (полученный «крепкий» раствор является устойчивым несколько месяцев). Перед опрыскиванием хроматограммы к 1 мл «крепкого» раствора добавляют 9 мл 20% раствора винной кислоты.
|
|
2. Раствор 10% хлорида окисного железа: 10г хлорида окисного железа (FeCl3) растворяют в достаточном количестве воды и доводят водой до 100 мл (реакция на фенольный гидроксил). Хроматограмму опрыскивают полученным раствором и наблюдают реакцию в течение не менее 30 минут (при приграничных концентрациях).
3. Раствор ферри-ферроцианида калия [3]: 57,7мг К3Fe (CN)6 и 4,9 мг К4Fe (CN)6растворяют в 100 мл воды (раствор хранят в холодильнике не более 1 мес. Для опрыскивания хроматограммы к 5мл основного раствора добавляют 3 мл 6% раствора гидроксида аммония и 2 мл этанола. Полученным раствором хроматограмму опрвскивают до увлажнения пластинки, нагревают при 1200С 2 мин., затем исследуют в УФ-свете (254-366нм). В случае морфина, а также 6-МАМ наблюдают лимонно-желтую (254нм) и ярко-голубую (366нм) флюоресценцию (образование псевдоморфина). Образование комплекса (при приграничных концентрациях) наблюдают не ранее чем через 30-40 минут. Морфин проявляется по сине-голубой, при стоянии - салатовой флуоресценции. Данная реакция достаточно специфична: не дают флуоресцирующих пятен морфинон, кодеин и его производные, дигидроморфинон, диацетилморфин, апоморфин, меперидин, метадон, апиперидин. Флуоресцирующие пятна образуют нор-морфин, п-аллил-нор-морфин, дигидроморфин, 6-ацетилморфин, наркотин, но разделяются при хроматографировании. Экстрактивные вещества, при исследовании указанной аликвоты, в зоне морфина по данной реакции флуоресцирующих пятен не образуют. Нижний предел обнаружения морфина 50-80 мкг. В случае слабой флуоресценции необходимо ещё несколько раз опрыснуть пластинку реактивом. Флуоресценция усиливается, пятна, соответствующие морфину, после проявления приобретают через сутки желтоватую окраску, заметную при дневном освещении и сохраняют свою флуоресценцию.
4. Пробу с реактивом Скотта (тиоцианат кобальта) проводят в модификации на пластинке ТСХ. Приготовление: 6,0г нитрата кобальта и 18,0г роданида калия (тиоцианата калия) растворить в 100 мл воды. голубое окрашивание дают многие алкалоиды и синететические основания (кроме никотина, анальгина, амидопирина, кофеина, бензофенонов)
5. Пробы Марки-Манделина и Марки (8): примерно 25 мл формальдегида в чашке помещали в стеклянную камеру (время насыщения не менее 30 минут). В камеру опускают хроматограмму, экспонируя ее в парах формальдегида в течение 5 минут, вынимают ее и сушат в течение 30сек при 500 С. Затем опрыскивают (под тягой) или обрабатывают методом погружения концентрированной серной кислотой или концентрированной серной кислотой, содержащей ванадат аммония (проба Марки-Манделина). Наблюдают окраску пятен, отмечают их карандашом, затем погружают пластинку в воду и быстро удаляют ее. При этом окраска пятен бледнеет. Для приготовления реактива Манделина, 200 мг ванадата аммония растворяют в 350 мл 95-97% серной кислоты.
6. Реактив Мекке (раствор селенистой кислоты или селенита натрия в концентрированной серной кислоте) [7], как и реактив Марки очень чувствителен в отношении алкалоидов опия, однако обладает более высокой изби-рательностью в отношении опиатов, позволяя определять их в присутствие экстрактивных веществ. Приготовление: 0,25 г селенистой кислоты (0,34г селенита натрия) растворить в 25 мл концентрированной серной кислоты.
Таблица 2.
Реакции обнаружения опиатов, некоторых наркотических и лекарственных веществ и наблюдаемые окраски при ТСХ-анализе на пластинках Сорбфил ПТСХ-ПА в системах растворителей 1 - 5.
Исследуемый препарат | Реактивы и результаты реакций (окраска пятен) | |||||
Реактив Драгендорфа | Реактив Марки- Манделина | К3Fe(CN)6+ К4Fe(CN)6 +УФ-свет 254-366 нм | Раствор тиоцианата кобальта (р-в Скотта) | Реактив Мекке | 10% раствор Fe Cl3 | |
Героин | оранжево- коричневое (0,2) | темно- фиолетовое (0,2) | - | голубое (0,3) | зелено-голубое (0,2) | - |
6-МАМ | оранжево- коричневое (0,2) | синее (0,3) | Желто-серое свечение (0,4) | То же | - | голубое (3-5 мкг) |
Кодеин | То же | Темно-синее (0,3) | - * | ,,,, | зелено-синее | - |
Морфин | ,,,, | фиолетовое (0,25-0,3) | голубая флюоресцен-ция (0,2) | ,,,, | зеленое (0,2) | синее (1,0) |
Наркотин | ,,,, | темно-фиолетовое | Слабая голубоватая флюоресцен –ция (100) | ,,,, | сине-зеленое | - |
Папаверин | ,,,, | пурпурно-фиолетовое | - | ,,,, | синее | - |
Промедол | ,,,, | малиновое | - | ,,,, | - | - |
Анальгин | оранжево- светло-коричневое | ,,,, (после разбав-ления водой) | - | - | - | малиновое |
Антипирин | То же | ,,,, | - | - | - | бордовое |
Димедрол | коричневое | лимонно-желтое | - | голубое | желтое | - |
Делагил | коричневое | - | фиолетовая** фл-я (в амми-ачной среде) | ,,,, | - | - |
Кокаин | темно- коричневое | - | - | ,,,, | - | - |
Кофеин | темно-фиолетовое | - | - | - | - | - |
Никотин норкотинин котинин | коричневое для всех 3-х соединений | - | - | - | - | - |
- | яркая флюор-я | - | - | - | ||
- | - | - | - | - | ||
Трамадол | коричневое | Коричневое, переходящ. в бирюзовое | - | голубое | серо-голубое | - |
Эфедрин | Светло-коричневое | - | - | сиреневое | - | - |
Экстрактивные вещества | коричневое | Темнокорич-нево-бурое | Голубая флю-оресценция | темно-зеленое | коричневое | буро-ко-ричневатое |
Примечание: Прочерк - отсутствие окрашивания; в скобках указаны пределы детектирования вещества (в мкг); * - желто-зеленая флюоресценция кодеина проявляется после обработки реактивом Марки, промывания и высушивания пластинки; ** - флюоресценция делагила проявляется в аммиачной среде без обработки ферри-ферроцианидным реактивом.
|
|
Пределы обнаружения опиатов в моче и внутренних органах методом ТСХ по разработанной методике анализа при использовании всего комплекса хромогенных реакций (при максимальной аликвоте, эквивалентной 0,5мл исследуемой мочи или 1,0 г ткани органов) составляют: для морфина - 1-5мкг/мл мочи (1-5 мкг/г ткани органов): для кодеина и героина - 1-2 мкг/мл мочи (1-2мкг/г ткани органа).
|
|
Пределы обнаружения опиатов в моче отдельными реагентами составляют: для морфина, кодеина, и героина при использовании реактива Драгендорфа - 0,5 мкг в пробе, при применении пробы Марки или Марки-Манделина - 1мкг в пробе; для морфина при обнаружении реакцией образования псевдоморфина - 1 мкг в пробе, при детектировании с хлоридом окисного железа - 2,5 мкг в пробе.
При исследовании загнившего трупного материала наряду с морфином можно обнаружить псевдоморфин, который также изолируется по описанной методике. В солянокислом растворе он имеет максимум поглощения при 261 нм, а при подщелачивании наблюдается батохромный сдвиг максимума не более, чем на 2-3 нм. Во всех описанных хроматографических системах псевдоморфин отделяется от морфина, имеет меньшую величину Rf по сравнению с морфином на 0,15-0,20, имеет голубовато-салатную флуоресценцию до проявления раствором ферри-ферроцианида калия. При проявлении реактивом Марки образуется зелёное окрашивание, всеми остальными реактивами – аналогичное морфину. Заключение об обнаружении псевдоморфина дают на основании результатов ТСХ и УФ – спектрофотометрии. Количественное определение не проводят.