Опыт № 1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

ПЦР - это высокоспецифичный метод экспресс-диагностики, позволяющий умножать определенные нуклеотидные последовательности к образованию неограниченного числа копий генов в таких количествах, которые можно обнаружить методом молекулярной гибридизации с помощью электрофореза.

Принцип метода. ПЦР базируется на многократном повторении циклов синтеза (амплификации) специфического участка ДНК-мишени с дезоксинуклеозидтрифосфатив в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы, соответствующего солевого буфера и олигонуклеотидных затравок-праймеров, определяющих границы амплифицированной участка ДНК-мишени. Для диагностики инфекционного заболевания подбираются системы праймеров, комплементарных специфическим для возбудителя участкам генов, которые позволяют амплифицировать фрагмент, имеющий для каждой системы праймеров свою длину.

Материальное обеспечение: 1) Оборудование: Амплификатор; автоматические микропипетки на 10 и 20 мкл; пластиковые пробирки на 0,2; 0,5 и 1,5 мл; одноразовые наконечники к микропипеток; Микроцентрифуга; вортекс; аппарат для электрофореза ДНК в агарозном геле; источник постоянного электрического тока (V - 50-250В, I - до 50мА); Трансиллюминатор с фильтром на 310 нм; ламинарный бокс или бокс для ПЦР; фотоаппарат с приставкой для регистрации результатов ПЦР. 2) Реактивы Набор для выделения ДНК из биопроб на 100 образцов (хранят при + 4˚С): раствор I (лизуючий) 30мл, раствор ИИ (промывочный) 10 мл, раствор ИИИ (промывочный) 200 мл, сорбент 1000 мкл, ТО -буфер 5мл.

2. Набор для выделения ДНК / РНК из сыворотки и плазмы крови на 100 образцов (хранят при + 4˚С): денатурированной раствор - 45 мл, изопропиловый спирт - 30 мл, промывочный раствор - 100 мл, раствор носителя - 300 мкл, вода дейонизована - 3 мл, хлороформ - 12 мл.

3. Набор для проведения ПЦР на 110 определений (хранить при температуре - 20 ° С): реакционная смесь 300 мкл, Тад-полимераза (5 ед / мкл) 25 мкл, вода дейонизована -2 мл, масло вазилинове - 2 мл, ДНК контрольная - 50 мкл. Реактив - термостабильную ДНК-полимеразы получают из специального штамма Bac. termophilis, сконструированного методами генной инженерии.

4. Набор для приготовления реакционной смеси, в состав которой входят: раствор дНТФ (дезоксинуклеозидтрифосфаты), раствор специфических праймеров, ПЦР-буфер, краситель. Основным реактивом здесь есть праймери- специфические для каждого вида участка ДНК; их получают химическим синтезом с соответствующей последовательностью для данного вида, что составляет 20-30 нуклеотидов. Праймеры патентуются и строго сохраняются.

Наборы предназначены для обнаружения invitro ДНК возбудителей инфекционных заболеваний в биологических образцах методом ПЦР с праймерами, специфичными к фрагментов геномов этого возбудителя и могут быть использованы для диагностики и контроля за специфической терапией определенной инфекции, а также бациллоносительства.

Ход работы:

1. подготовка клинических образцов (биоптаты тканей, капля крови, сперма, слизь женских половых органов, осадок мочи, волос человека, соскобы эпителиальных клеток и т.п.);

2. выделение ДНК из образцов (ДНК-матрицы генов клеток, вирусов и бактерий более устойчивы, чем РНК, и поэтому они пригодны для ПЦР после длительного времени);

3. проведение циклов полимеразной цепной реакции (реакции амплификации) - каждый цикл состоит из трех стадий с различными температурными режимами.

На первой стадии при 94˚С проходит разделение цепей ДНК (денатурация ДНК);

На второй при 50-65˚С - присоединение (отжиг) праймеров к гомологичных последовательностей на ДНК-мишени;

На третий при температуре 72˚C - синтез новых цепей ДНК, то есть комплементарная достройка ДНК путем удлинения праймера в направлении 5'-3 'с участием ДНК-полимеразы в присутствии ионов магния.

Таким образом, в первом цикле амплификации синтезируются продукты, которые становятся матрицами для второго цикла амплификации, в результате которого образуется исследуемый фрагмент ДНК - ампликонов. Начиная с третьего цикла, ампликонов становятся матрицами для синтеза новых цепей, то есть в каждом цикле осуществляется удвоение количества копий, позволяющая с 25-40 циклов наработать фрагмент ДНК, ограниченный парой отобранных праймеров, в количестве, которого достаточно для ее детекции с помощью электрофореза;

4. разделение продуктов амплификации методом горизонтального электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле; обнаруживают полосы фрагментов ДНК (ампликонов) с помощью флуоресцентного красителя (хромофора) - бромистого этидия;

5. переноса геля на стекло трансиллюминатора;

6. анализ результатов при включенном Трансиллюминатор, а именно выявление фрагментов рассматриваемой ДНК в виде оранжево-красных полос при УФ-излучении с длиной волны 310 нм; количество апмпликонив определяют по интенсивности их флуоресценции. Полученные результаты можно документировать фотографированием гелей с использованием оранжевого или интерференционного (594 нм) светового фильтра.

Значение для фармации и клиники. Цель прикладной генетической инженерии заключается в конструировании таких рекомбинантных молекул ДНК, которые при внедрении в генетический аппарат придавали бы организму свойства, полезные для человека. Например, получение «биологических реакторов» - микроорганизмов, растений и животных, продуцирующих фармакологически значимые для человека вещества.

В медицине метод ПЦР применяется для диагностики инфекций путем идентификации патогенных бактерий и вирусов в биологических материале. С целью диагностики каждой инфекции подбираются специфические системы праймеров для ПЦР. С помощью ПЦР одну молекулу идентифицированной ДНК можно обнаружить в присутствии миллионов других молекул ДНК. Чувствительность реакции 97-99%. ПЦР широко используется в ранней диагностике ВИЧ-инфекции, бациллоносительства, вирусных гепатитов и т.д., а также для мониторинга и оценки специфической терапии определенной инфекции, резистентности и чувствительности к антибиотикам.

Кроме того метод ПЦР используют для выявления наследственных заболеваний (фенилкетонурия, гемофилия и др.), Проведение "молекулярной дактилоскопии" в судебной практике, установление отцовства, установление пола ребенка на 10-й неделе беременности, в онкологии и тому подобное.