Возбудители пищевых токсикоинфекций

К пищевым токсикоинфекциям относятся острые кишечные заболевания, возникающие при употреблении в пищу продуктов, в которых произошло большое размножение бактерий и накопление токсинов, выделяемых при гибели микробов или в процессе их жизнедеятельности. К возбудителям токсикоинфекций относятся: Е. faecalis, Bac. cereus, Proteus vulgaris (Р. mirabilis), Vibrio рarahaemolyticus, Cl. Perfringens (такие болезни, как эшерихиоз, сальмонеллез, дизентерия, иерсиниоз тоже протекают по типу токсикоинфекции, но их изучают как возбудителей самостоятельных нозологических болезней).

Пищевые токсикоинфекции различной этиологии характеризуются целым рядом общих клинических и эпидемиологических признаков. Заболевание начинается мгновенно и протекает остро после короткого инкубационного периода среди лиц, употреблявших одну и ту же пищу, как правило, приготовленную с нарушением технологии или длительное время хранившуюся перед реализацией. Эпидемиологически заболевание характеризуется взрывным началом, протекает по типу вспышки, прекращается сразу после изъятия продукта, послужившего причиной токсикоинфекции, не оставляет эпидемического хвоста.

Патогенетические изменения в организме и клиническая картина при пищевых токсикоинфекциях, вызванных различными микроорганизмами, характеризуются похожими признаками, так как их развитие зависит от действия токсических веществ микробов (эндотоксина), токсинов — продуктов распада белков пищевого продукта, а не от вида возбудителя. Одновременное проникновение большого количества бактерий и их

разрушение в регионарных лимфатических образованиях кишечника ведут к освобождению значительного количества эндотоксина, который оказывает местное влияние на желудочнокишечный тракт, вызывая воспалительный процесс, нарушение всасывающей способности кишечника.

В первые часы заболевания наступают и общетоксические явления: повышение температуры тела, головная боль, слабость.

Заболевание начинается с явлений гастроэнтерита: рвоты, жидкого стула (до 10–15 раз в сутки), болей. Продолжительность болезни 1–3 дня в легких случаях, осложнения бывают у детей и людей пожилого возраста.

Энтерококки, или фекальный стрептококк (Е. faecalis), широко распространены в природе. В настоящее время энтерококки считаются вторыми после БГКП санитарно-показательными микроорганизмами (СПМ) при исследовании бассейнов, сточных вод, почвы. Во многих странах (Англии, Франции, США, Хорватии и т. д.) энтерококки признаны дополнительным показателем фекального загрязнения питьевой воды. Они относятся к стрептококкам группы Д, обитающим в ротовой полости, кишечнике человека и животных. Их постоянно обнаруживают в фекальных массах, хотя в количественном отношении их меньше (108–109 в 1 г), чем кишечных палочек. У здоровых людей доминирующим видом является E. faecаlis, однако санитарно-показательными служат и остальные виды — E. faecium и E. durans. Энтерококки отличаются по ряду признаков от стрептококков других групп, в частности, патогенных гемолитических групп А, которые способны вызывать пищевые отравления и дисбактериозы кишечника.

Морфология. Слегка вытянутые кокки размером 0,6–2,5 мкм, расположенные попарно и в виде цепочек, грамположительные, спор и капсул не образуют.

Культивирование. Хорошо растут на простых средах, температурный оптимум +37_С (в интервале +10...+45_С), факультативные анаэробы, хемоорганотрофы (метаболизм ферментативный), пищевые потребности сложные. На МПА через сутки образуют мелкие, серовато-белые колонии, а МПБ становится мутным, на дне появляется плотный белый осадок.

Биохимические свойства. Расщепляют различные углеводы (чаще до кислоты) — лактозу, сахарозу, салицин, маннит, арабинозу, галактозу; проба на каталазу отрицательная, в редких случаях восстанавливают нитраты. Изменяют цвет лакмусового молока. МПЖ — не разжижают. Дифференцирующим признаком является способность развиваться на питательных средах, содержащих 6,5% NaCl, 40% желчи и метиленовую синь. Для выделения фекального энтерококка из исследуемого материала, обильно загрязненного сопутствующей микрофлорой, применяют селективные среды: щелочно-полимиксиновые, желчно-полимиксиновые, агар с азидом натрия.

Вульгарный протей. Первого представителя P. mirabilis выделил из гниющего мяса Хаузер (1885), предложивший название рода, обусловленное способностью его представителей менять внешние проявления роста на твердых средах (в честь сына Посейдона — водяного божества Протея, изменяющего свой облик в различных обстоятельствах). Место их обитания — кишечник многих видов животных, почва, сточные воды, разлагающиеся органические массы. Являются третьей по значимости группой санитарно-показательных микроорганизмов. Наибольшее санитарно-показательное значение имеют P. vulgaris и P. mirabilis. При этом наличие P. vulgaris обычно рассматривают как показатель загрязнения объекта органическими веществами, а обнаружение P. mirabilis — как показатель фекального загрязнения.

Морфология. Вульгарный протей имеет форму палочки длиной 1–3 мкм. Палочки часто полиморфные, грамотрицательные, перитрихи, капсул не образуют.

Культивирование. Оптимальная температура +37 С (+10...+43 С), рН 7,2–7,4. Относятся к факультативным анаэробам, хемоорганотрофам, метаболизм дыхательный и ферментативный.

Биохимические свойства. На МПА образуют два типа колоний: О форма, неподвижные — образуют круглые, выпуклые, серо-белые колонии; Н форма, подвижные — для них характерен феномен роения, на котором основан метод выделения чистой культуры посевом в конденсационную воду скошенного агара по Щукевичу. Н_формы дают сплошной, ползучий рост с образованием концентрических колец роста по периферии, поэтому «понятие изолированной колонии» к ним неприменимо.

Уникальная способность к «феномену роения» используется как один из характерных признаков при определении вида. Наличие в питательной среде ингибиторов (солей желчных кислот, больших концентраций NaCl, мочевины, препаратов йода) обусловливает переход протея в неподвижную О форму. На МПБ наблюдается обильное помутнение, нежная пленка. Рост культуры сопровождается характерным гнилостным запахом.

По биохимическим свойствам данная культура очень активна: расщепляет углеводы до кислоты и газа (глюкозу, сахарозу, но не лактозу), восстанавливает нитраты, гидролизует мочевину, вызывает быстрое разжижение МПЖ (см. вклейку, ил. VI), образует индол и H2S, ферментирует каталазу, оксидаза-отрицательна. Обычно ацетилметилкарбинол не образует. Важнейшим признаком, отличающим протей от других энтеробатерий, является способность дезаминировать фенилаланин, при разложении которого до фенилпировиноградной кислоты в присутствии FeCl2 происходит окрашивание питательной среды в зеленый цвет.

На среде Плоскирева формирует желтовато-розовые колонии, среда в зоне роста желтеет в результате подщелачивания. На висмут-сульфитном агаре через 48 ч образует серо-коричневые колонии. На агаре Эндо колонии бесцветны, так как они не расщепляют лактозу.

Антигенная структура обусловлена наличием О, Н и К антигенов, которые используются для серологической дифференциации при определении вида.

Основными источниками загрязнения протеем окружающей среды являются люди и животные. В 5–9% случаев протей обнаруживается в содержимом желудочно-кишечного тракта и фекалиях здоровых животных и людей. Проникновение протея в мясо и мясные продукты происходит эндогенным и экзогенным путем. Эндогенное заражение отмечается при жизни животного, особенно при возникновении гастроэнтеритов и других болезней. Но основным путем инфицирования продуктов питания является экзогенный. Кожный покров животных — один из основных источников загрязнения мяса в процессе переработки туш скота. Применение дезинфицирующих растворов для обработки кожного покрова (0,5–2%_ный раствор хлорной извести) значительно уменьшает его микробное загрязнение, в том числе и протеем.

Из продуктов убоя здоровых животных протей чаще всего можно выделить из печени, реже — селезенки и соматических лимфоузлов. Присутствие его в воде, пищевых продуктах и смывах свидетельствует о неблагополучном санитарном состоянии, загрязнении объекта разлагающимися органическими субстратами. Пищевые продукты, загрязненные протеем, обычно выбраковывают. Воду, содержащую протей, пить нельзя. При исследовании качества пищевых продуктов индикация палочки протея предусмотрена ГОСТом. Bac. cereus широко распространены в природе и в большинстве случаев являются сапрофитами.

Морфология. Подвижные, грамположительные палочки длиной до 4,0 мкм располагаются одиночно и цепочками, образуют эндоспоры.

Культивирование. Аэробы, мезофилы, оптимальная температура +30_С. На МПА — колонии с зубчатыми краями. На МПБ — помутнение, нежная пленка, хлопьевидный осадок.

Биохимические свойства. На МПЖ — кратерообразное разжижение за 1–4 дня, обладают лецитовителазной активностью. Лакмусовое молоко не свертывают, индол не образуют. Глюкозу и сахарозу расщепляют до кислоты. Бациллы образуют энтеротоксины только in vivo во время прорастания спор. Бациллы Bac. cereus вызывают два типа пищевых отравлений.

Первый тип: инкубационный период 4–5 ч, характеризуется изнурительной рвотой, диареей. Заболевание развивается при употреблении пищи, обсемененной большим количеством микроорганизмов. Зачастую наблюдаются случаи отравления в связи с употреблением жареного риса, содержащего проросшие споры Bac. cereus. Эти случаи можно считать токсикозами, связанными не столько с активностью токсина, сколько с действием метаболитов, накапливающихся в пищевых продуктах.

Второй тип — продолжительность инкубационного периода 17 ч, патогенез полностью опосредован действием энтеротоксина, вызывающего боли в животе, диарею. Критерии санитарной оценки продуктов, загрязненных Bac. cereus, окончательно не разработаны. В 1 г сырья не должно содержаться более 100 микробных клеток Bac. cereus. В пастеризованных консервах наличие Bac. cereus не допускается. Диагностическим признаком считается обнаружение Bac. cereus в подозрительных продуктах в количестве более 105 бактерий в 1 г/мл. Но даже накопление в продукте микроорганизмов в пределах 106–107 и более не приводит к значительному изменению внешнего вида продукта и органолептических признаков.

Cl. perfringens широко распространен в природе. Основной резервуар сохранения патогенных штаммов — желудочно-кишечный тракт здоровых животных, где он размножается и попадает в почву с фекалиями. Таким образом, он входит в

состав нормальной микрофлоры кишечника, количество клостридий в 1 г содержимого кишечника доходит до 103–106 в 1 г.

Микроб относится к санитарно-показательным микроорганизмам, хотя споры могут долгое время сохраняться в объектах внешней среды.

На основании антигенного строения различают шесть сероваров. Типы А и С вызывают пищевые токсикоинфекции у людей. Термолабильный протеин, выделяемый при споруляции, провоцирует рвоту, диарею и летальный исход.

Морфология. Толстые, неподвижные, грамположительные палочки, до 5–8 мкм длиной. Располагаются одиночно, изредка короткими цепочками.

Внешний вид прибора для бактериологического анализа воздуха: вентиль ротаметра; ротаметр;накидные замки; диск вращающийся; крышка; диск;клиновидная щель; корпус;основание.

Образуют споры клостридиального типа спороношения; очень устойчивые во внешней среде; выдерживают кипячение до 2 ч, при этом сама вегетативная клетка малоустойчива. В организме, входя в ассоциацию возбудителей, вызывающих газовую гангрену, или злокачественный отек, образует капсулу.

Культивирование возбудителя проводят в среде Китта–Тароцци, где он дает равномерную муть и газообразование уже через 4–6 ч после посева. Для выращивания посевов на поверхности среды в чашках Петри применяют анаэростат. Возможна быстрая индикация на среде Вильсон–Блера за счет восстановления железа и появления черных колоний через 8–12 ч. Вода, подаваемая на предприятия пищевой промышленности, должна проверяться на присутствие Сl. perfringens. Их количество строго контролируется: в 100 мл воды не допускается наличие ни одной клостридии.

Определение присутствия клостридий перфрингенса как возбудителя пищевых отравлений проводят и в некоторых пищевых продуктах.

Критический уровень Cl. perfringens в готовых блюдах равен 10 клеткам в 1 мл или 1 г продукта. Готовые консервы не должны содержать палочки и споры Cl. perfringens. Cl. perfringens можно выявить в специях, мясном фарше.

При нарушении условий хранения пищевых продуктов количество Cl. perfringens уже за 3 ч может увеличиться в 10 раз.

Чаще всего причиной вспышек токсикоинфекций, вызванных Cl. perfringens типа А, являются мясные продукты, изготовленные с нарушением установленных требований гигиены и санитарии или хранившиеся при температуре выше +5_С, а также изделий из мяса птицы, свежей и соленой рыбы, реже — молока и молочных продуктов, салатов и др. Инкубационный период обычно равен 6–24, реже — 2–3 ч.

Обязательным условием возникновения токсикоинфекций является накопление в пищевом продукте большого количества (в 1 г — 106) жизнеспособных бактерий. Энтеротоксин, образующийся в организме человека, увеличивает проницаемость кровеносных сосудов и усиливает поступление жидкости в полость кишечника. Заболевания могут протекать в легкой и тяжелой формах.

При легкой форме изменения в желудочно-кишечном тракте небольшие, при тяжелой отмечаются резкие воспалительные и некротические процессы в кишечнике с явлениями острейшего гастроэнтерита.

В отдельных мясных продуктах (пастеризованные консервы) наличие Cl. perfringens не допускается. Если хотя бы в одном из посевов обнаружены мезофильные клостридии Cl. Perfringens и/или Cl. вotulinum, консервы оценивают как не соответствующие стандартам промышленной стерильности.

К пищевым токсикозам относятся бактериальные токсикозы: ботулизм, стафилококковая интоксикация.

Ботулизм (от лат. botulus — колбаса) — тяжелый пищевойтоксикоз, возникающий в результате употребления продуктов,зараженных палочкой ботулизма и ее экзотоксинами.Возбудитель ботулизма широко распространен в природе(почве, навозе, воде) и часто попадает в мясо из окружающейсреды. Это строгий анаэроб, который размножается и выделяет экзотоксин в консервах, соленой рыбе, колбасе, ветчине, грибах домашнего консервирования.

Консервированные продукты, загрязненные спорами ботулизма. При нарушении технологических процессов стерилизации или хранении консервов при температуре выше +15...+17 Св консервированных продуктах, зараженных спорами ботулизма, данные споры прорастают и вегетативные палочки ботулизма начинают продуцировать экзотоксин.

Изучено 7 сероваров экзотоксина — A, B, C, D, E, F, G, различающихся по антигенной структуре. В патологии человека имеют значение экзотоксины типа А, В, С, Е (у типа А самый сильный токсин).

Типизацию токсина проводят в реакции нейтрализации с гомологичными антитоксическими сыворотками согласно прилагаемой к ним инструкции. Ботулинический токсин отличается наибольшей токсичностью из всех известных микробных экзотоксинов (0,035 мг сухого порошка токсина является смертельной дозой для человека).

Экзотоксин всасывается в желудок и кишечник, поражает черепно-мозговые нервы, приводя к атрофическому параличу мышц лица и носоглотки: появляется двойное видение, нарушается глотательный акт, исчезает голос (афония). Инкубационный период длится от нескольких часов до 10–12 суток. В настоящее время доказано, что не только токсин, но и сам возбудитель может быть причиной отравления. Споры ботулизма, попавшие в организм, превращаются в вегетативные клетки и продуцируют экзотоксин, приводящий животное к гибели, при этом сам возбудитель выделяется из всех органов и тканей. В связи с этим мясо больных ботулизмом животных нельзя использовать в пищу.

Морфология. Cl. botulinum крупные — до 8,0 мкм, располагаются одиночно или короткими цепочками, подвижные, грамположительные палочки. Капсулу не образуют. Образуют споры через 48 ч, расположение споры субтерминальное.

Культивирование. Строгий анаэроб, оптимальная температура для типа А, В, С, D +34...+36_С, для Е, F, G— +28...+30 C, рН — 7,2–7,4. На специальных плотных питательных средах в глубине образует колонии в виде «чечевицы» или комочков ваты. На МППБ — обильное помутнение, запах прогорклого масла и газ.

Биохимические свойства. Расщепляют до кислоты и газа глюкозу, мальтозу, сахарозу, салицин, декстрозу и глицерин. МПЖ разжижается, кусочки печени расплавляются, мозговая среда чернеет. На кровяном агаре вызывает гемолиз эритроцитов. На поверхности кровяного агара образует колонии двух типов — S – R колонии. Возбудитель ботулизма очень устойчив к неблагоприятным факторам. Споры хорошо переносят абсолютный холод, в почве сохраняются десятилетиями, выдерживают кипячение в течение 3–6 ч. Устойчивы к действию дезинфицирующих средств, например, к 20%_ному формалину — 24 ч, к этиловому спирту — в течение 2 месяцев, к 5%_ной карболовой кислоте — в течение 24 ч.

Снижение рН среды позволяет уменьшить длительность обработки и температурного воздействия, даже если в этих продуктах содержатся споры ботулизма.

Например, споры погибают при температуре +100_С уже через несколько минут, если кислотность окружающей среды рН снижена до 3,5–4,5. Не удается культивирование Cl. botulinum в слабокислой среде—в пределах рН 4,5. Экзотоксин к высокой температуре не устойчив, он разрушается при кипячении через 15 мин, а при +80_С— через 30 мин.

Стафилококки широко распространены в природе. В настоящее время различают два вида стафилококков: сапрофитные и патогенные. Сапрофитные обитают в почве, воде, воздухе и на поверхности растений. Патогенные стафилококки находятся на кожном покрове, а также на слизистых оболочках глаз, носа, ротовой полости, кишечника и так далее человека и животных. Это позволяет отнести их к санитарно-показательным микро-

организмам — индикаторам воздушно-капельного загрязнения некоторых пищевых продуктов и объектов внешней среды. Основная роль в инфекционной патологии животных и человека принадлежит S. aureus, S. pyogenes.

Морфология. Стафилококки — округлые клетки диаметром 0,5–1,5 мкм, в препаратах располагаются в виде отдельных скоплений неправильной формы, напоминающих гроздь винограда. Грамположительные, спор и капсул не образуют, неподвижны.

Культивирование. Факультативные анаэробы. Хорошо растут на универсальных питательных средах при температуре +35...+40_С (возможна жизнедеятельность в интервале от +6,0 до +46_С, оптимум рН 7,0–7,5. Относятся к галофилам, способны расти в присутствии 15%#ного хлорида натрия или 40%ной желчи, что используется при индикации и идентификации.

На МПА образуют круглые с ровными краями колонии диаметром 2–5 мм. S. aureus синтезирует золотистый или оранжевый пигмент, встречаются и беспигментные штаммы. При росте в МПБ стафилококки образуют диффузное помутнение с последующим выпадением рыхлого хлопьевидного осадка. На МПЖ растут по уколу, затем образуют воронку, наполненную жидкостью. На кровяном агаре патогенные штаммы стафилококков образуют значительную зону гемолиза.

Патогенные стафилококки синтезируют и секретируют высокоактивные экзотоксины и ферменты. Среди экзотоксинов выделяют три вида: гематоксины, лейкоцидин и энтеротоксины.

Устойчивость. Стафилококки — относительно устойчивые микроорганизмы, прямые солнечные лучи убивают их только через несколько часов. В жидкой среде при температуре +70 С погибают через 1 ч, при +85_С— через 30 мин, при +100 С—за несколько секунд. Сухой жар убивает их за 2 ч. Из дезинфектантов 1%_ный раствор формалина и 2%ный раствор гидроокиси натрия убивают их в течение 1 ч, 1%_ный раствор хлорамина — через 2–5 мин. Стафилококковое пищевое отравление — типичный бактериальный токсикоз, занимающий по распространенности второе место после сальмонеллезной инфекции. Симптомы развития токсикоза обусловлены действием экзотоксина и энтеротоксина, выделяемых стафилококками и накапливающихся в продуктах. Энтеротоксин термостабилен, выдерживает кипячение до 30 мин и лишь частично разрушается после автоклавирования при 0,5 атм.

Энтеротоксины A, B, C, D, E и F ответственны за развитие пищевых интоксикаций. Развитие болезни такое же, как при других пищевых отравлениях, проявляется рвотой, болями и диареей уже через 2–6 ч после употребления в пищу инфицированных продуктов, обычно кондитерских изделий с кремом, консервов, мясных и овощных салатов.

Все типы токсинов не разрушаются под воздействием протеолитических ферментов (трипсин, хемотрипсин), однако при низких значениях рН пепсин инактивирует стафилококковый энтеротоксин. Он устойчив к воздействию желудочного сока, хлора, формалина. Внешний вид продуктов, содержащих энтеротоксин, не изменяется.

Энтеротоксины — термостабильные полипептиды; образуются при размножении энтеротоксигенных стафилококков в питательных средах, продуктах питания (молоко, сливки, творог и др.), кишечнике. Они устойчивы к действию пищеварительных ферментов. Энтеротоксины вызывают пищевые токсикозы человека, к ним чувствительны кошки, особенно котята, и щенки собак. Установлено, что экзотоксин полностью не разрушается при получасовом или даже часовом кипячении.

Наличие энтеротоксина в пищевых продуктах и культурах определяют в РДП со стафилококковыми антисыворотками к энтеротоксинам А, В, С, D, Е, F.

Лабораторная диагностика. Для выделения стафилококков и обнаружения энтеротоксина молоко исследуют при маститах, кровь — при септицемии, остатки продуктов — при пищевых отравлениях.

Исследуемый материал одновременно сеют в чашки с накопительными средами: молочно-солевым и желточно-солевым агаром. На чашках с молочно_солевым агаром учитывают образование пигмента. На желточно-солевом агаре большинство патогенных стафилококков вызывают лецитовителлазную реакцию, проявляющуюся образованием вокруг колонии зоны помутнения с радужным венчиком по периферии. С выделенной культурой ставят реакцию плазмокоагуляции с цитратной плазмой крови кролика: при наличии у стафилококка фермента коагулазы плазма свертывается.

В пищевых продуктах с наличием стафилококков и их токсинов органолептические изменения не происходят. Интоксикации стафилококкового происхождения связаны с накоплением в инфицированной пище энтеротоксина. Классическое проявление поражения человека отмечается, когда в продукте (1 г) содержится 105–107 стафилококков, вырабатывающих токсин, 1 мкг которого вызывает пищевую интоксикацию.

При подтверждении диагноза молоко коров, больных маститами, рекомендуется кипятить и использовать для кормовых целей, так как токсины и другие продукты патологического обмена ухудшают его качество и делают его совершенно непригодным в пищу. Продажа молока от маститных коров запрещена.

Обеззараживание условно годного мяса. При генерализованном процессе, обнаружении изменений в органах всю тушу вместе с органами направляют на техническую утилизацию.

Пищевые отравления смешанной этиологии обусловлены совместным действием двух и более возбудителей, например, Bac. cereus со Staph. aureus или Bac. cereus совместно с E. coli.

Пищевые отравления грибковой этиологии — это отравления, вызванные размножением токсигенных плесневых грибов, которые выделяют микотоксины в процессе жизнедеятельности, а также при разрушении мицелия. Известны более 200 видов

грибов, способных при определенных условиях продуцировать микотоксины. Данная проблема находится в центре внимания ВОЗ, институты питания разрабатывают предельно допустимые концентрации (ПДК). Например, наличие афлотоксина допускается до 5 мг/кг, а патулина — до 50 мг/кг.

Отбор средней пробы. В лабораторию посылают пробу массой 500 г. Диагностика микотоксикозов особенно трудна, так как возбудитель и токсин надо обнаружить как в исследуемых продуктах, так и в организме больного.

1. Органолептическая оценка включает изучение внешнего вида, цвета, запаха корма, зерна, орехов, сырья, готовых продуктов питания и т. д.

2. Микроскопическое исследование. Видимые части мицелия, находящиеся на поверхности исследуемого продукта, вносят на предметное стекло в каплю, состоящую из равных объемов глицерина, спирта и воды, закрывают покровным стеклом, далее изучают микрокартину с увеличением в 400 раз. Обращают внимание на строение мицелия и органов спороношения, наличие перегородок. Особую трудность при идентификации представляет то, что микроскопические грибы часто имеют различную морфологию в естественном субстрате и искусственных питательных средах, поэтому применяются различные дополнительные исследования для определения вида и токсичности выделенных микроскопических грибов.

3. Микологическое исследование присланного продукта, корма проводят параллельно и одновременно в двух направлениях:

3.1. Посев на питательные среды для определения вида (см. вклейку, ил. IV, IX, X). Для выращивания применяютспециальные питательные среды: Сабуро, Чапека, сусло-агар,в состав которых вводят антибиотики или ингибиторы, подавляющие развитие сопутствующей бактериальной микрофлоры.

Культивирование посевов проводится при температуре +25...+28_С в течение 3–10 дней, по мере появления колоний приступают к определению рода и вида микроскопических грибов. Для этого изучают культуральные и морфологические признаки выросших грибов.

3.2. Токсикобиологическое исследование проводят для обнаружения микотоксина в исследуемом продукте и токсичности гриба. Для этого применяются следующие методы:

-биопроба на животных с последующим наблюдением;

-проба на простейших;

-кожная проба на кроликах;

-химический метод (тонкослойная хромотография).

Биопроба на животных проводится для обнаружения микотоксина в исследуемом продукте или корме. Используют 10 молодых белых мышей весом 20–25 г или морских свинок.

Суточную норму корма заменяют исследуемым продуктом или кормом, который скармливают не менее 10 дней подряд. Токсикоз проявляется быстрее, если кормить подопытных животных на голодный желудок. Изучают появившиеся клинические признаки: рвота, диарея, взъерошенная шерсть. Затем животных усыпляют, исследуют внутренние органы, отмечают наличие кровоизлияний, жировое перерождение тканей печени, желудка.

Определение токсичности выделенных микроскопических грибов можно провести пробой на простейших парамециях - Paramecium caudatum. Из культуры грибов, выращенных на среде Чапека, готовят водный экстракт по следующей методике: мицелий гриба помещают в пробирку и заливают стерильной водой в соотношении 1:1, встряхивают и экстрагируют 24 ч в холодильной камере при температуре +4_С. Каплю полученного экстракта наносят на предметное стекло и в эту же каплю вносят взвесь простейших. Если выросший гриб был токсичным, парамеции через 3–5 мин прекращают движение, а в дальнейшем происходит их гибель и лизис клеток.

Более сложный метод — это «кожная проба на кроликах». Для постановки данной пробы 50 г исследуемого измельченного корма или продукта, в котором определяют наличие токсического гриба, помещают в банку и заливают спирт-эфиром (1: 3), так чтобы жидкость была на 2–3 см выше изучаемого продукта, экстрагируют 24 ч при комнатной температуре, периодически встряхивая. Затем полученный экстракт процеживают через фильтровальную бумагу в бюкс, который ставят в вытяжной шкаф до полного испарения растворителя. Для ускорения испарения сосуды с экстрактами ставят в водяную баню при температуре +45...+50_С. В результате этого на дне остается токсин в виде маслянистой массы.

Для постановки кожной пробы используют кроликов весом 2 кг с непигментированной кожей, за несколько часов до опыта выстригают участок кожи 3_6 см. Полученный токсин дважды через сутки втирают в подготовленный участок кожи кролика, затем наблюдают за появляющимися изменениями. Для предупреждения расчесывания и слизывания нанесенного экстракта на шею кролика надевают картонный воротник. В зависимости от степени токсичности микроскопических грибов на коже кролика последовательно появляются покраснение, утолщение кожной складки, выпотевание экссудата, трещины и некроз кожи.

Для определения гемолитической активности полученного токсина применяют химический метод. На поверхности кровяного агара в чашке Петри раскладывают 5 дисков из фильтровальной бумаги, на которые наносят каплю полученного маслянистого токсина, диффундирующего в толщу агара. Если исследуемый продукт или корм содержал токсичный микроскопический гриб, происходит лизис эритроцитов и вокруг дисков появляются прозрачные зоны различного диаметра в зависимости от силы токсина. На контрольные диски наносят растительное масло, вокруг них не должно быть никаких изменений.