Определение амилазной активности слюны

БИОЛОГИЯ И ФИТОДИЗАЙН

Занятие 3. Тема: Ферменты, их свойства. Классификация и номенклатура ферментов.

Цель занятия: изучить классификацию и свойства ферментов.

Студент должен:

знать:

ü строение ферментов;

ü классификацию ферментов;

ü уравнение Михаэлиса-Ментен, условия его выполнения и способы линеаризации;

ü три типа ингибирования ферментативной активности.

уметь:

ü объяснять химические свойства ферментов, их активаторов и ингибиторов;

ü определять тип ферментативного ингибирования по форме графика скорости ферментативной реакции.

ОСНОВНЫЕ ВОПРОСЫ

Строение и свойства ферментов: термолабильность, зависимость активности от значения рН среды, ионной силы раствора, специфичность, влияние на ферменты активаторов и ингибиторов. Конкурентное, неконкурентное и бесконкурентное ингибирование ферментов. Уравнение Михаэлиса-Ментен.

Номенклатура ферментов. Научная (Московская, 1961 г.) номенклатура. Систематические и рабочие (тривиальные) названия ферментов. Шифры ферментов.

Классификация ферментов. Классы ферментов: оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы и лигазы (синтетазы). Характеристика основных подклассов и подподклассов перечисленных классов.

Литература для самоподготовки:

1. Лекционный курс

2. Филиппович Ю.Б. Основы биохимии. М.: Агар, 1999. С. 95-147.

Лабораторная работа: изучение свойств ферментов.

Литература для самоподготовки:

Филиппович Ю.Б.Практикум по общей биохимии. – М.: Просвещение, 1982. С. 80-85.

Дополнительная литература

Комов В.П., Шведова В.Н. Биохимия. – М.: Дрофа, 2004. С. 59-92.

Кнорре Д.Г., Мызина С.Д. Биологическая химия. – М.: Высш. шк., 2003. – С. 128-162.

Лабораторная работа к занятию 3. Тема: ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ФЕРМЕНТОВ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИЛАЗНОЙ АКТИВНОСТИ СЛЮНЫ

Амилазную активность слюны выражают в количестве субстрата (крахмала), расщепляемого 1 мл слюны за определенный промежуток времени (30 мин). Определение основано на нахождении максимального разведения, при котором слюна еще расщепляет крахмал полностью за взятый промежуток времени. О наличии или отсутствии крахмала в растворе судят по йодной реакции.

Оборудование и реактивы: р-р I+KI, 0,1%-ный р-р крахмала, пробирки, штативы, пипетки, стаканчики на 50 мл, фарфоровые чашечки, водяные бани, стаканы, электроплитки, термометры.

Ход работы:

1. Наливают в 8 пронумерованных пробирок по 1 мл дистиллированной воды.

2. В первую пробирку отливают 1 мл слюны, разведенной водой в 10 раз. Для получения слюны, разведенной в 10 раз, необходимо 20 мл воды подержать во рту 2 мин.

3. Перемешивают содержимое первой пробирки путем втягивания пипеткой жидкости из пробирки и последующего выпускания из пипетки.

4. Переносят 1 мл из первой пробирки во вторую.

5. Перемешивают содержимое второй пробирки, переносят 1 мл из второй пробирки в третью и т.д. до восьмой пробирки. Из восьмой пробирки 1 мл жидкости выливают. Таким образом, получают ряд разведений.

6. Наливают во все 8 пробирок по 1 мл дистиллированной воды.

7. Наливают во все пробирки, начиная с восьмой, по 2 мл 0,1% -го раствора крахмала и перемешивают содержимое каждой пробирки.

8. Одновременно помещают все 8 пробирок в нагретую до 37 °C водяную баню.

9. Через 30 мин пробирки вынимают и охлаждают током холодной воды. В штатив ставят по порядку номеров.

10. Приливают в каждую пробирку по 2 капли йода. Желтый цвет в пробирках свидетельствует об отсутствии крахмала, красно-бурый – о присутствии промежуточных продуктов расщепления, синий – о наличии крахмала.

11. Вычисляют амилазную активность исследуемой слюны; достаточное расщепление крахмала имеет место в той пробирке, где нет синего оттенка. Для примера, пусть это будет 5-я пробирка. В 5-й пробирке неразведенной слюны было 1/320 мл, т.е. можно записать: 1/320 мл слюны расщепляет 2 мл 0,1%-ного раствора крахмала. 1 мл слюны расщепляет x мл 0,1%-ного раствора крахмала. Х= 2 / (1/320) = 640. Следовательно, 1 мл неразбавленной слюны за 30 мин при 37 °С расщепляет 640 мл 0,1%-ного раствора крахмала.

ВЛИЯНИЕ рН НА ДЕЙСТВИЕ ФЕРМЕНТОВ.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ рН ОПТИМУМА ДЕЙСТВИЯ АМИЛАЗЫ

Ферменты очень чувствительны к изменению кислотности среды, в которой они действуют. Можно считать, что для каждого фермента имеется определенная концентрация протонов, при которой он наиболее активен. Изменение кислотности среды в ту или иную сторону от оптимума рН вызывает понижение активности фермента.

Оборудование и реактивы: 0.1 М р-р лимонной кислоты, 0.2 М р-р Na₂HPO₄×2H2O, 30% р‑р H₂SO₄, р-р I+KI, 0,1% и 1%-ный р-р крахмала, индикаторная бумага универсальная, пробирки, штативы, пипетки на 2 и 5 мл, стаканчики на 50 мл, цилиндры на 25 и 50 мл, фарфоровые чашечки, водяные бани, стаканы, электроплитки, термометры.

Ход работы:

1. В стаканчиках на 50 мл готовят буферные растворы в соответствии с данными таблицы. Определяют рН растворов с помощью индикаторной бумаги.

2. Берут 5 пробирок, в каждую приливают по 2 мл буферных растворов, 2 мл 1%-ного раствора крахмала, 2 мл слюны, разведенной в 20 раз.

3.Содержимое каждой пробирки перемешивают и оставляют стоять на 10-15 мин. Время ориентировочное. Необходимо контролировать ход гидролиза через каждые 5 мин. Для этого из пробирки с рН 6.8 берут на фарфоровую чашечку 1 каплю жидкости и проводят реакцию с йодом. Опыт лучше прекращать при неполном расщеплении крахмала (красноватая окраска продуктов реакции). Для прекращения опыта во все пробирки добавляют по 2 капли йода. На основании полученной в пробирках окраски судят о степени расщепления крахмала в зависимости от рН. Там, где крахмал расщепляется наиболее полно, было оптимальное значение рН для действия амилазы.