Описание лабораторных работ, выполняемых на занятии

Работа 1. Активаторы и ингибиторы α-амилазы слюны

Метод основан на сравнении скорости гидролиза крахмала (продукт гидролиза крахмала обнаруживают пробой с йодом) под действием α-амилазы слюны до и после добавления фенилтиомочевины, ионов Cl^- и Cu²⁺.

Ход определения. Берут 4 пробирки и наливают по 10 капель: в первую – дистиллированной воды, во вторую – раствора хлорида натрия, в третью – раствора сульфата меди, в четвёртую – раствора фенилтиомочевины, а затем по 20 капель раствора крахмала и по 1 капле разведённой слюны. Содержимое перемешивают встряхиванием, помещают пробирки в водяную баню при 38°С и засекают время начала инкубации.

Через каждую 1-2 минуты из пробы отбирают в другие пробирки по 1 капле жидкости и добавляют 1 каплю раствора иода в иодиде калия. Отмечают время появления красного окрашивания (стадия образования эритродекстринов) при проведении реакции с йодом в каждой из пробирок.

Оформление работы. Результаты занести в таблицу, сделать вывод о действии изученных веществ и предполагаемом типе ингибиторов.

Вывод:

Работа 2. Действие конкурентных ингибиторов на сукцинатдегидрогеназу мышечной ткани

Метод основан на сравнительном определении активности сукцинатдегидрогеназы по обесцвечиванию в ходе реакции метиленовой сини (МС) как акцептора водорода в присутствии и в отсутствие малоновой кислоты

Образующийся ФАД∙Н₂ восстанавливает метиленовую синь (МС∙Н₂), в результате чего происходит обесцвечивание раствора. Сравнивая визуально уменьшение интенсивности уменьшение синего окрашивания с пробами, содержащими разные количества малоновой кислоты (НООС-СН₂-СООН), делают вывод о типе действия её на фермент.

Ход определения. В 3 пробирки помещают по 3-4 грамма мышечной кашицы и добавляют в первую пробирку 0,8 мл воды, во вторую – 0,2 мл раствора малоновой кислоты и 0,6 л воды, а в третью – 0,8 мл раствора малоновой кислоты.

Во все пробирки приливают по 1 мл раствора сукцината натрия, по 1 капле раствора метиленового синего и после перемешивания по 3-4 капли вазелинового масла. Пробирки ставят в водяную баню при 37°С. Через 3-5 мин наблюдают обесцвечивание раствора.

Оформление работы. Сравнить интенсивность голубого окрашивания в трёх пробирках и сделать вывод о механизме действия малоновой кислоты на активность сукцинатдегидрогеназы.

Результат:

Вывод:

Практическое значение работы. Конкурентные ингибиторы различных ферментов широко применяются в биохимических исследованиях и в практической медицине как лекарственные препараты. В частности, малоновая кислота как конкурентный ингибитор сукцинатдегидрогеназы используется в экспериментах на животных для того, чтобы изучить изменения в обмене веществ в тканях при блокаде этого фермента, а также для исследования самого механизма конкурентного торможения.

Работа 3. Неконкурентное ингибирование каталазы крови.

Метод основан на визуальном сравнении интенсивности выделения пузырьков газа (кислорода) при разложении пероксида водорода с участием каталазы крови в отсутствие и в присутствии азида натрия NaN₃.

Ход определения. В 2 пробирки вносят по капле крови и добавляют в одну из них 2 капли воды, а в другую – такой же объём раствора азида натрия. Пробы встряхивают.

Через 2 минуты прибавляют в обе пробирки по 2 мл 3%-ного раствора пероксида водорода и сравнивают интенсивность выделения пузырьков газа.

Оформление работы. По полученным данным сделать вывод о действии азида натрия на каталазу крови и указать на практическое значение работы.

Практическое значение работы. Неконкурентными ингибиторами геминовых ферментов (цитохромы, цитохромоксидаза, каталаза, пероксидаза) являются азиды и цианиды, которые взаимодействуют с железом гемма, входящего в активный центр, подавляя тем самым каталитическую активность этих ферментов. Благодаря этому азиды и цианиды являются сильными ядами. Учитывая, что они неконкурентные ингибиторы, снять их действие можно только теми веществами, которые связывают их и освобождают из активного центра фермента.