Определение кариотипа или хромосомного набора человека

1 2 3 4 5

Назначение: определение кариотипа человека;

Реагенты и биологические материалы:

1. периферическая кровь человека;

2. фетогемаглютинин (ФГА);

3. колхицин;

4. краситель Гимза;

5. сыворотка крупного рогатого скота;

6. среда RMPI – 1640;

7. трипсин;

8. фосфатный буфер;

9. ледяная уксусная кислота;

10. серная кислота;

11. стандартный титр;

12. гидроокись натрия;

13. иммерсия;

14. гепарин;

Принцип: световая микроскопия;

Ход работы:

Забор крови производится натощак путем венепункции из локтевой вены.

1. приготовление рабочего раствора гепарина: 0,5 мг гепарина разбавить в 9,5 мл 0,9% NaCI;

2. в стерильный флакон внести гепарин 10 – 20 единиц на 1 мл крови;

3. во флакон с гепарином стерильно провести забор крови в количестве 2-3 мл крови;

4. встряхнуть смесь кровь с гепарином;

5. приготовление питательной смеси: в 4 – 5 мг среды RPMI – 1640 добавить 1 мл сыворотки крупного рогатого скота в расчете 5 – 5,5 мл на 1 мл крови;

6. приготовление рабочего раствора ФГА путем внесения 5 мл 0,9% NaCI;

7. приготовление гипотонического раствора KCI: 0,56 гр KCI растворить в 100 мл дистиллированной воды;

8. приготовление маточного раствора колхицина: 10 мл колхицина растворить в 100 мл дистиллированной воды;

9. приготовление рабочего раствора колхицина: 0,5 мл маточного раствора колхицина растворить в 10 мл дистиллированной воды;

10. приготовление 3% рабочего раствора ледяной уксусной кислоты: фиксатор этанол добавить ледяную уксусную кислоту в соотношении 3:1;

11. приготовление рабочего раствора для окрашивания метафазных пластин: фосфатный буфер 10 мл + дистиллированная вода 190 мл + краска Гимза 2,4 мл;

12. подготовка предметных стекол к работе проводится путем отмывания в моющем растворе, обезжиривание в растворе хромовой смеси, отмывание в под проточной водой и дистиллированной. Хранить в дистиллированной воде при +4.

13. стерильно во флакон с кровью внести 3 капли ФГА;

14. добавить питательную смесь среды в расчете 5 – 5,5 мл на 1 мл крови;

15. флакон инкубируют в термостате при +37 в течение 72 ч;

16. на 70 часу добавить колхицин 0,25 – 1 мкг на 1 мл;

17. перенести содержимое флакона в центрифужную пробирку;

18. центрифугировать в течение 6 мин при 3000 об/мин;

19. удалить надосадочную жидкость;

20. ресуспензировать осадок в 8 мл гепатонического раствора KCI;

21. инкубировать 30 – 45 мин в термостате при +37;

22. см. п.19;

23. см. п.20;

24. налить 8 мл 3% уксусной кислоты;