Молекулярні механізми формування та руху пухирців

Завдяки процесам формування, направленого транспорту та злиття пухирців склад мембрани кожного внутрішньоклітинного компартменту залишається постійним після закінчення процесу переносу речовин. Правильне направлення пухирців до певної мембрани необхідно як для підтримання життєдіяльності окремої клітини, так і для нормального функціонування клітин у складі тканини.

Головним механізмом, за допомогою якого білки та ліпіди переміщуються у клітині, є відбруньковування пухирців. Пухирці формуються із мембрани однієї органели – донора,та переміщуються до іншої органели – акцептора. Це призводить до злиття донорної та акцепторної мембран та вивільнення вмісту пухирця у порожнину акцептуючого компартменту. В результаті цього процесу відбувається перебудування клітинних компартментів та поверхні клітини, а також збереження або руйнування міжклітинних контактів.

Слід відмітити, що клітина має певні гомеостатичні механізми, які регулюють та підтримують склад мембрани кожної органели, та запобігають, крім усього іншого, зменшенню розмірів донору та збільшення розмірів акцептору. Це здійснюється шліхом повернення мембран. Це призводить до формування в клітині двох транспортних потоків:

· перший потік - антероградний транспорт – транспорт розчинних вантажних білків по секреторному шляху – від ГрЕР до цис-сітки Гольджі;

· другий потік - ретроградний транспорт – повернення з КГ до ЕР певних рецепторних білків та ліпідів.

Роздільний транспорт антероградних вантажних білків та компонентів, що транспортуються ретроградно, забезпечується, як мінімум, двома класами білків зі специфічною білковою каймою, які зв’язуються з транспортними пухирцями. Це білкові комплекси носять назву коатомерів або СОРs. Їх об’єднують у два класи – це відповідно СОР І та СОР ІІ. Кайма пухирців СОР І та СОР ІІ морфологічно однакова, однак різна за біохімією.

Вивчаючи перенос глікопротеїнів через апарат Гольджі у безклітинній системі, Ротман із співробітниками виявили локалізацію цитозольних білків, які закріплюються на мембрані комплексу Гольджі та формують протеїнову кайму. Ці білки утворюють комплекс з 8 субодиниць – коатомер або СОР І. Крім того, у коатомерному комплексі був виявлений невеликий GTP-зв’язувальний білок, який називають фактором ребозилювання аденозиндіфосфату ( ADP ribosylation factor, ARF).

При генетичному дослідженні дріжджових клітин було показано, що СОР І, скоріш за все, залучається до зворотного транспорту мембранних компонентів з апарату Гольджі до ЕР, а не у антероградному транспорті.

Другий білок кайми з 5 субодиниць, був біохімічно та генетично охарактеризований у дріжджових клітинах. Він приймає участь у антрероградному транспорті від ЕР до комплексу Гольджі. У клітинах ссавців були виявлені еквівалентні субодиниці СОР ІІ. Ці білки концентруються у проміжних елементах ЕР ацинарних клітин підшлункової залози та b-клітин острівців Лангерганса. Проміжні елементи, вперше описані Palade (1975), походять з вільних від рибосом цистерн ЕР та містять транспортні білки, що направляються до апарату Гольджі.

На основі біохімічних характеристик, стосовно СОР І та СОР ІІ та їх взаємодій з мембранами, була сформульована проста модель поведінки СОР у процесі везикулярного транспорту. Вантажні білки, розчинні або зв’язані з мембраною, транспортуються антероградно у пухирцях, облямованих СОР ІІ (від ЕР до апарату Гольджі), а у пухирцях, облямованих СОР І, білки та ліпіди (у тому числі білки, відповідні за зв’язування розчинних білків ЕР) транспортуються з цис-зони апарату Гольджі до ЕР.

Слід відмітити, що залишається ще далеким від повного розуміння питання зв’язування СОР-І та СОР-ІІ з мембранами. За однією з моделей, в цьому процесові ключова роль належить так званим молекулярним або біохімічним перемикачам, специфічним молекулам-активаторам біохімічних реакцій в клітині. Це, як правило, гідролітичний фермент, який відщеплює термінальний фосфат від гунін- (найчастіше) або аденозинтрифосфату (ГТФ або АТФ). У “вимкненому” стані зв’язаний нуклеотид знаходиться у формі дифосфату (ГДФ). При зміні ГДФ на ГТФ конформація білку-перемикача змінюється, в результаті чого він зв’язується з молекулою-мішенню та активує її. Після того, як активована клітина-мішень активує свою власну мішень, гідролітична частина білку відщеплює термінальний фосфат від зв’язаного нуклеотидтрифосфату, а білок повертається до ГДФ-зв’язаного стану, тобто вимикається.

Один з типів такого молекулярного перемикача, білок ARF або його дріжджовий еквівалент Sar1p, залучені, як вважають, до приєднання СОР-І та СОР-ІІ до мембрани. Білок ARF (мол. маса 20 кДа) містить на N-кінці міристиновий жирнокислотний залишок, що посилює взаємодію білку з мембраною. При заміні ГТФ на ГДФ, комплекс ARF-ГТФ зв’язується з мембранами, що спричинюється виниклими конформаційними змінами, яки призводять до зв’язування N-кінцевого домену з мембраною-мішенню шляхом його інкорпорування у ліпідний бішар мембрани. Активована форма ARF (чи його аналогу), тобто комплекс ARF-ГТФ спричинює (полегшує?) приєднання везикулярної кайми, що і призводить до приєднання СОР-І чи СОР-ІІ до мембрани. При гідролізі ГТФ, ARF-ГТФ відділяється від мембрани, призводячи до розібрання облямовочного комплексу.

Залишається незрозумілим сам механізм приєднання СОР до мембрани за участю ARF. Припускають, що ARF активує мембранну фосфоліпазу D в апараті Гольджі. Продукт же її ферментативної активності – фосфатидна кислота – (а зовсім не сам білок ARF) приєднує коатомерні субодиниці до мембрани апарату Гольджі.

Пізніші дослідження показали, що облямовані коатомерами пухирці не можуть злитися з мембраною акцептора до видалення білкової кайми, на відміну від необлямованих. Але для злиття з мембранами-мішеняим останніх необхідна присутність в цитозолі NSF – N-етилмалеімід-чутливого фактору (він інактивується під дією сульфогідрильного алкіліруючого реагенту - N-етилмалеіміду). Дріжджові клітини мають еквівалент NSF – продукт гену sec18.

NFS – це тример з трьох ідентичних субодиниць масою 76 кДа, який приєднує розчинні білки SNAPs (soluble NFS attachment proteins), що опосередковують зв’язування з мембранами апарату Гольджі. Комплекс NFS-SNAPs зв’язується з мембранами за допомогою мембранного рецептору – пастки (SNARE).

Першими виявленими у ссавців пастками були великі мембранні білки нейрональних синаптичних пухирців – синатобревин, синтаксин та розчинний мембранний білок SNAP-25. Їх функціональні гомологи також були виявлені у дріжджів, більш того, саме для дріжджів було показано, що мутація будь-якого з цих трьох білків інгібує заключні етапи секреції. Це змушує думати про спільність механізмів процесів секреції у ссавців, вивільнення нейротрансмітерів з синаптичних пухирців та секреції у дріжджів.

Згадаємо участь ще одного білку – клатрину – у формуванні транспортних пухирців. Механізм утворення облямовочних пухирців є характерним на лише, навіть не стільки, для процесів секреції, як для ендоцитозу. Відомо, що поглинання ліганд-рецепторних комплексів з поверхні плазматичної мембрани відбувається шляхом утворення облявочних ямок, які потів перетворюються у облямовочні пухирці. Специфічні комплекси білку клатрину формують кошикоподібну структуру, у яку і втягується мембранний бішар. У випадку плазматичної мембрани позаклітинна речовина зв’язується з поверхнею пухирця, що формується. Речовина ж з порожнини комплексу Гольджі, навпаки, втягується у пухирець, який формується на внутрішньоклітинній мембрані. Таким чином, вкриті клатрином пухирці залучені до транспорту речовин від плазматичної мембрани до ендосом і від апарату Гольджі до плазматичної мембрани.

Слід сказати, що клатрин є гексамером, який складається з трьох великих і трьох дрібніших поліпептидів. Така гексамерна структура, названа трискеліоном, і утворює згадану кошикоподібну структуру, яка з’єднується з 5-6 іншими клатриновими одиницями. Структура, як показав електронномікроскопічний аналіз, може мати пентагональну або гексагональну конфігурацію. Але залишається нез’ясованим, що ініціює утворення клатринового кошика. Відомо лише, що процес ендоцитозу супроводжується потовщенням мембрани у місцях формування клатринового кошика. Інвагінація мембрани у кошик формує мембранну ямку. Продовження групування молекул клатрину закінчується відщепленням від мембрани повністю облямованого пухирця, після чого клатриновий кошик руйнується. Припускають, що в процесі цього енергозалежного руйнування не останню роль відіграють іони Са²⁺. При формуванні крупніших інвагінацій мембрани, як у випадку фагоцитозу, формуються клатринові ділянки, що не вкривають ендоцитовану структуру, функціональне призначення яких залишається невідомим. Вкриті клатрином пухирці утворюються також і з транс-сітки Гольджі, звідкіля вони транспортую секреторні білки до плазматичної мембрани та потім у позаклітнний простір.

Нагадаємо, що цитоплазматична частина трансмембранного білку часто несе послідовності, які ініціюють біомолекулярні каскади у цитоплазмі. При зв’язуванні ліганду з рецептором вивільнюється сигнальний домен інтерналізації, який маскує видалення ліганд-рецепторного комплексу з клітинної поверхні. У цьому випадку білковий комплекс, який носить назву адаптину, розташований зразу за мембраною, впізнає сигнальний домен та запускає процес інтерналізації, активуючи формування клатринової кайми. На сьогодні відомо багато адаптинів, вважають, що вони сприяють специфічності транспорту для ряду рецепторів.

Сформовані пухирці можуть злитися з різними мембранами. Для реалізації цільового надходження пухирців, відбрунькованих від донорної мембрани, кожний пухирець має спеціальну рецепторну молекулу – пастку-п (для пухирця). Акцепторна (цільова) мембрана, в свою чергу, також має рецептор (пастку-ц), який зв’язується з пасткою-п. Для злиття мембрани пухирця з акцепторною мембраною необхідним є також спеціальний білок злиття – фузіонний білок. Цей білок дестабілізує гідрофільні сили у місті взаємодії двох мембран. Коли дві мембранні поверхні наближуються одна до одної, гідрофобний домен білку злиття направляє молекули води у різні боки, і зовнішні ліпідні шари зливаються один з одним. Теж саме відбувається і при злитті внутрішніх шарів. Але не дивлячись на те, що фузіонний білок ссавців ідентифіковано, фізико-хімічні аспекти мембранного злиття не з’ясовані.

Наприкінці, вважаємо за доцільне торкнутися ще однієї важливої теми: участі ГТФаз в процесах внутрішньоклітинного транспорті пухирців.

В клітинах існує два типи залучених до процесів клітинної сигналізації ГТФаз: тримери (що складаються з a, b та g субодиниць) та мономери (що складаються з одного поліпептиду). Тримірні ГТФази є великою родиною білків, що називають G-білками. Вони залучені до переносу сигналів з позаклітинного простору у внутрішньоклітинний. Кожна тримірна субодиниця приймає участь у переносі різних сигналів до цільових молекул.

Мономерних ГТФаз на сьогодні виявлено 5 підродин:

· Ras – приймають участь в процесах росту та диференціювання,

· Rho – пов’язані з активністю інтегрину та формуванням актинового цитоскелету,

· Rab - приймають участь в транспорті пухирців в клітині,

· ARF – пов’язані з формуванням пухирців,

· Ran - приймають участь в транспорті білків ядра.

Кожна підродина ГТФаз включає багато білків, але найбільш вагомі з них Ran та ARF, знайдені на різних субклітинних рівнях. Мономерні ГТФази функціонують як молекулярні перемикачі: їх конформація змінюється залежно від того, чи знаходяться вони у ГТФ- чи ГДФ-зв’язаному стані. Rab-білки також залучені до везикулярного транспорту: пухирець, сформований в мембрані донора, містить пастку-п, рпо яку ми вже згадували, та молекулу Rab у ГТФ-зв’язаній конфігурації. Коли пухирець стикується з відповідною пасткою-ц, Rab-ГТФаза гідролізується. Цей процес і ініціює злиття пухирця з мембраною акцептора. Rab у ГДФ-зв’язаній конфігурації відщеплюється від мембрани і повертається до мембрани донора, де ГТФ-активуючий білок відновлює Rab, каталізуючи злиття з ГТФ. Це призводить до того, що Rab зв’язується з ліпідноючастиною мембрани і залучається до нового направленого процесу. Для кожної внутрішньоклітинної мембрани існує свій специфічний Rab-білок, який забезпечує певний напрямок пухирців.