Сайт-специфическая рекомбинация

Сайт-специфическая рекомбинация происходит между специфическими последова­тельно­стями ДНК в пределах очень коротких участков гомологии, обычно 15-30 п.н. Она широко рас­пространена у прокариот и низших эука­риот. Сайт-специфическая рекомбинация обеспечивает интеграцию (включе­ние) ДНК умеренных фагов в хромосомы бактерий, инверсию (изменение ориентации) отдельных участков ДНК в хромосомах бактерий и бактериофагов и в так называе­мой 2-микронной плазмиде дрожжей, а также другие про­цессы, играющие важную роль в циклах развития фагов и бактерий. Редкий, если не единственный, но зато жизненно важный пример сайт-специфической рекомби­нации у многоклеточных животных - перестройки в последователь­ностях ДНК, кодирую­щих иммуноглобулины, - белковые молекулы, распо­знающие тот или иной антиген при иммунном ответе у позвоночных.

Рассмотрим некоторые из самых известных примеров сайт-специфиче­ской рекомби­нации. Наиболее изучена она у умеренного бактериофага лям­бда. После инфек­ции в клетку E. coli ли­нейная вирионная двуцепочечная ДНК фага (рис. 1, а) замыкается в кольцо (рис. 1, б) за счет имеющихся на ее кон­цах комплементарных одно­цепочечных последовательностей. Последую­щее развитие фага может идти по пути интеграции в хромосому бактерии между генами gal и bio (рис. 1, в). Ин­теграция происходит путем рекомбинации ме­жду особыми att (attachment)-сайтами: attP в хромосоме фага и attB в хромо­соме бактерии. Интегрирован­ный фаг называется профа­гом. Он фланкирован ре­комбинантными сайтами attL (левый) и attR (правый). Вырезание (эксци­зия) профага из хромосомы про­исходит в обратной последовательности событий. Запись реак­ций в обобщен­ном виде представлена на рис. 1, г. Из нее видно, что в интегративной реком­би­нации участвуют сайты attP и attB, продукт фа­гового гена int (интеграза) и белок IHF (Integration Host Factor) E. coli. Для экс­цизии необходимы сайты attL и attR, те же белки и еще продукт фаго­вого гена xis. Сайты attP и attB нерав­ноценны. Первый устроен сложно. При размере около 270 п.н. он состоит из центральной части О и двух примыкающих к ней частей: P и P'. Внутри сайта attP располагаются участки связывания с интегра­зой и белками IHF и Xis. Сайт attB устроен проще. Его размер всего 23 п.н., го­мология с attP ог­раничена цен­тральной частью из 15 п.н., в которой имеются два сайта связывания с ин­тегразой. Инте­граза является топоизомеразой типа I, но только сайт-специ­фической. В результате об­разования комплекса инте­гразы с attP-сайтом и белком IHF формируется сложно уложен­ная нуклеопро­теидная структура, ко­торая захватывает сайт attB. В этой структуре после­до­вательности ДНК att-сайтов связываются за счет взаимодей­ствий между субъе­диницами интегразы и затем подвергаются согласованному расщеплению.

Как и все топоизомеразы I, интеграза делает разрыв в одной цепи каж­дого дуп­лекса, и в месте разрыва образуются 3'-P и 5'-OH-концы ДНК. Фер­мент ковалентно свя­зывается с 3'-P-кон­цом, благодаря чему энергия разо­рванной фосфодиэфирной связи со­храняется, и для после­дующего замыкания разрыва, осуществляемого тем же ферментом, не требуется дополнительной энер­гии. Этим топоизомеразы отличаются от ДНК-лигаз, использующих для сшивания концов цепей ДНК энергию, освобождающуюся за счет гид­ролиза соединений типа АТФ. Поэтому разрыв по­линуклеотидной цепи, образуемый то­поизомеразой, называют "временным" в отличие от фикси­рованных одноце­почечных раз­рывов, производимых эндонуклеазами. При этом интеграза мо­жет осуществлять рекомби­нацию между att-сайтами путем замыкания фосфо­диэфирной связи с 5'-OH-концом из другого дуплекса, то есть путем обменов 5'-OH-концами. Такая рекомбинация ме­жду ду­плексами, не требующая до­полнительной энергии, называется консервативной.

На рис. 2 изображены только основные детали сложного молекулярного процесса интегратив­ной рекомбинации. В упрощенном виде его можно пред­ставить следующим образом: сначала интеграза производит обмен между двумя цепями одинаковой поляр­ности. При этом разрыв и воссоединение це­пей происходят между строго определен­ными нуклеотидами в центральной части att-сайтов (рис. 2, а). В результате возникает структура, физически со­ответствующая полу­хиазме Холлидея (рис. 2, б). Затем на рас­стоянии 7 п.н. происходит вторая пара обменов между двумя другими цепями, не участ­во­вавшими в первом обмене. Вторая пара обменов приводит к интеграции фага (рис. 2, в); интегрированный профаг фланкирован рекомбинантными сайтами attL и attR, как это уже было показано на рис. 1, в. Предполагается, что для катализа этой реак­ции необхо­димы четыре субъединицы интегразы, связанные в att-сайтах.

Важно отметить, что все изученные ферменты, непосредственно осуществ­ляющие сайт-спе­цифическую рекомбинацию у фагов и бактерий, а также белок, катализирующий инверсию в 2-микронной плазмиде дрожжей, явля­ются сайт-специфическими топоизоме­разами I. По уровню гомологии их ами­нокислотных последовательностей и механизму катализирумых реакций их разделяют на две группы: представителями первой группы являются уже рас­смотренная нами интеграза фага лямбда, интегразы других умеренных фагов и белок, катализирующий сайт-спе­цифическую рекомбинацию в плаз­миде дрож­жей, ко второй относят инвертазы бактерий и фагов и некоторые другие ферменты сайт-специфической рекомбинации.

Сайт-специфическая рекомбинация, катализируемая ферментами второй группы, про­исходит по более простой схеме, чем в случае интеграз. Рассмот­рим ее на примере инвертазы фага Mu. В центральной части своей хромосомы фаг содержит особый сегмент G размером около 3 т.п.н. Сегмент имеет на концах инвертированные (обращенные) по­вторы длиной около 30 п.н. В каж­дом повторе, в свою очередь, имеется специфический рекомбинационный сайт. Инвертаза про­водит рекомбинацию между этими сайтами (рис. 3, а). Четыре субъединицы фермента, по одной субъединице на каждую цепь ДНК, делают "временные" разрывы в обеих цепях каждого реком­бинационного сайта, то есть одно­временно расщепляют все четыре цепи, образуя 5'-P и 3'-OH-концы. При этом разрывы цепей в каждом дуплексе происходят на рас­стоянии 2 п.н., так что 3'-конец как бы вы­ступает. Фермент ковалентно связы­вается с 5'-P-концами. Затем одна часть пер­вого дуп­лекса меняется местами с такой же частью второго дуплекса, после чего восстанавлива­ются фосфоди­эфирные связи во всех четырех цепях.

Приведенная реакция, как и большинство из процессов, осуществляемых инверта­зами у бакте­рий кишечной группы и их фагов, входит в особую сис­тему сайт-специфи­ческих инверсий ДНК, получившую название Din (от DNA inversions). Помимо фага Mu сайт-специфические инверсии обнаружены у умеренного фага P1 и энтеробактерий E. coli, Salmonella typhimurium, Citrobacter freundii. Инверсии специальных сегментов хро­мосом, ограничен­ных обращенными повторами ДНК длиной около 30 п.н., происходят с высо­кой частотой путем рекомбинации в этих повторах. Меняя ориентацию опре­делен­ных генов относительно их промоторов, инверсии приводят к включе­нию одних генов и выключению других. Это один из примеров регуляции ра­боты генов пу­тем специфиче­ских перестроек ДНК. Они имеют приспособи­тельное значение. Например, у S. typhimurium инверсии сегмента H переклю­чают гены H1 и H2, кодирующие разные типы белка флагеллина, из которого построены жгутики, что позволяет этой патогенной для мышей бактерии ме­нять поверхностный антиген и тем самым ускользать от действия им­мунной системы хозяина. У фагов инверсии переключают гены, кодирующие разные белки хвостовых отростков, что при­водит к смене хозяев - бактерий, в кото­рых может размножаться фаг.

В качестве конкретного примера вернемся к системе инверсий G-сег­мента у фага Mu (рис. 3, б). Сегмент содержит четыре гена: U, U ', Sv и Sv '. Два последних представ­лены в сегменте только своими вариабельными час­тями, тогда как их общая константная часть Sc вместе с про­мотором P примы­кает к сегменту слева. Справа от сегмента G распо­ложен ген инвертазы gin. При одной ориентации сегмента (G+) транскрибируются гены Sv и U, при противоположной ори­ентации (G-) функционируют гены Sv' и U '. В первом слу­чае фаг размножается на E. coli B, E. coli K12 и S. typhimurium, во втором - на E. coli C, Citrobacter freundii, Shigella sonnei и др. Следует особо отметить, что все работающие в системе Din инвертазы фагов и бактерий заменяют друг друга в рекомбинации in vitro. Это обусловлено их общим происхождением: инвертазы гомоло­гичны между собой на 60-70% и их рекомбинационные сайты в обращенных повторах на концах инвертируемых сегментов также го­мологичны.

Завершая описание сайт-специфической рекомбинации отметим ее прин­ципиаль­ные отличия от гомологичной рекомбинации. В случае последней молекулы ДНК узнают друг друга путем прямого сопоставления их последо­вательностей через посредство ре­комбиназ типа белка RecA. Для этого в ДНК вводятся специальные пресинаптические по­вреждения, высвобождающие од­ноцепочечные участки ДНК, что и лежит в основе узнава­ния гомологичных последовательно­стей. Напротив, при сайт-специфической рекомбина­ции главную роль в си­напсисе играет взаимное узнавание белков, связанных с ре­комби­национными сайтами. Эти сайты совсем короткие, и го­мология между ними непосредст­венно для синапсиса несущественна. Она важна для связыва­ния со специфи­ческими бел­ками и для обмена цепями между сайтами.