Кількісне визначення ЛПНЩ та ЛПДНЩ і загальних ліпідів у сироватці крові

Завдання 1. Визначити вміст ЛПНЩ та ЛПДНЩ у сироватці крові турбідиметричним методом за Бурштейном і Самай.

Принцип. Метод базується на здатності гепарину утворювати комплекс з ЛПНЩ та ЛПДНЩ сироватки крові, який під дією кальцію хлориду випадає в осад. Ступінь помутніння розчину пропорційний вмісту цих ліпопротеїнів у сироватці крові.

Хід роботи. У кювети ФЕК з товщиною шару 5 мм наливають по 2 мл розчину 0,025 моль/л кальцію хлориду. Встановлюють «нуль» при довжині хвилі 720 нм (червоний світлофільтр). В одну кювету приливають мікропіпеткою 0,2 мл сироватки, декілька раз промивають піпетку. Відзначають початкове значення екстинкції Е₁, потім додають мікро­піпеткою 0,04 мл розчину гепарину, що містить 1 000 одиниць у 1 мл, декілька раз промивають піпетку. Перемішують вміст кювети, через 4 хв (за секундомером) знову вимірюють екстинкцію Е₂. Вміст ЛПНЩ та ЛПДНЩ (Х) у г/л у сироватці крові розраховують за формулою:

Х = (Е₂ – Е₁) × 11,65,

де 11,65 – емпіричний коефіцієнт перерахування вмісту ліпопротеїнів на г/л.

Клініко-діагностичне значення. При ультрацентрифугуванні крові виділяються ліпопротеїни різної щільності: високої (ЛПВЩ), низької (ЛПНЩ), дуже низької (ЛПДНЩ) та інші. Фракції ліпопротеїнів відрізняються за кіль­кістю білка і вмістом у відсотках окремих ліпідних компонентів. Так, ЛПВЩ містять велику кількість білка (50–60%), мають і більш високу відносту щільність (1,063–1,210), тоді як ЛПНЩ і ЛПДНЩ містять менше білка, значну кількість ліпідів – до 95% маси і мають низьку відносну щільність (1,010–1,063). У нормі вміст ліпопротеїнів сироватки крові складає 3,6–6,5 г/л. Підвищення рівня ліпопротеїнів тісно пов’язане зі збільшенням кількості холестеролу в крові; ним найбагатші β-ліпопротеїни. Збільшення вмісту β- і пре-β-ліпопротеїнів спостерігають при атеросклерозі, цукровому діабеті та інших захворюваннях.

Завдання 2. Визначити вміст загальних ліпідів у сироватці крові.

Принцип. Метод базується на здатності продуктів розпаду ненасичених ліпідів утворювати з фосфатнованіліновим реактивом забарвлену сполуку; інтенсивність забарвлення пропорційна вмісту загальних ліпідів у сироватці крові.

Хід роботи. У суху дослідну пробірку вносять 0,1 мл сироватки крові й обережно додають 2,9 мл концентрованої сульфатної кислоти, а в контрольну – 0,2 мл води і 5,8 мл концентрованої сульфатної кислоти. Вміст обох пробірок ретельно перемішують скляною паличкою і поміщають на киплячу водяну баню на 10 хв (обережно!). Потім обидві пробірки швидко охолоджують під струменем холодної води до кімнатної температури. З дослідної пробірки відбирають 0,2, а з контрольної – 0,4 мл охолодженої суміші в інші пробірки, в які заздалегідь наливають фосфатнованіліновий реактив: у дослідну – 3 мл, у контрольну – 6 мл. Після ретельного перемішування скляною паличкою проби ставлять на 45 хв у темне місце при кімнатній температурі для розвитку забарвлення.

Фотометрують дослідну пробу проти контрольної на ФЕК при 500–560 нм (зелений світлофільтр) у кюветі з товщиною шару 5 мм. Вміст загальних ліпідів Х у г/л у сироватці крові розраховують за формулою:

Х = m × 10 000 × 3/ 0,2 × 1 000,

де m – маса загальних ліпідів проби, знайдена за калібрувальним графіком (мг); 10 000 – коефіцієнт перерахунку на 1 л сироватки крові; 1 000 – коефіцієнт перерахунку мг в г; 3 – загальний об’єм початкової суміші (мл)–0,1 мл сироватки крові + 2,9 мл концентрованої сульфатної кислоти; 0,2 мл – об’єм суміші, узятої для проведення кольоровох реакції (мл).

Клініко-діагностичне значення. Вміст ліпідів крові (зокрема тригліцеридів, фосфоліпідів, холестеролу) в комплексі з білками (альбумінами) та у формі ліпопротеїнів є важливим діагностичним показником. Нормальний вміст загальних ліпідів у сироватці крові становить 4–8 г/л. Збільшення вмісту ліпідів у крові (гіперліпідемія) як фізіологічне явище відбувається через 1–4 год після споживання багатої на ліпіди їжі. Натще рівень загальних ліпідів дещо знижується (гіполіпідемія). Збільшення концентрації ліпідів у крові спостерігається при діабеті (до 10–20 г/л), цирозі печінки, атеросклерозі, ожирінні, ішемічній хворобі серця, ліпоїдному нефрозі (захворювання нирок), гострому гепатиті, панкреатиті в осіб, що зложивають алкоголем.