Содержание занятия

Бактериологическое исследование воды преследует цели: определить общее количество микробов в 1 см³ воды, определить коли-индекс, оценить качество воды в санитарно-гигиеническом отношении по коли-индексу.

Для исследования набирают воду в стерильную посуду вместимостью 0,5…1 л с ватными или притертыми стеклянными пробками, которые закрывают бумажными колпаками и завязывают у горловины. Пробы хлорированной воды отбирают в склянки, в которые перед стерилизацией в автоклаве вносят 10 мг гипосульфита натрия Na₂S₂O₃ • 2H₂ на 0,5 л воды. В посуду, стерилизованную сухим жаром, вносят 2 см³ раствора гипосульфита перед отбором пробы, причем строго следят за тем, чтобы не произошло загрязнения пробы из воздуха. Взятая вода должна быть тотчас представлена на исследование. Если лаборатория находится на большом расстоянии, посуду с пробой воды необходимо сохранять в ведре со льдом.

При взятии проб воды из водопроводных кранов последние предварительно стерилизуют, обжигая пламенем паяльной лампы или горящим тампоном, смоченным спиртом, затем сливают воду из крана в течение 10 мин и только после этого наполняют посуду. Пробы воды с больших глубин набирают при помощи батометра. Всего воды набирают 350…500 см³. Воду необходимо исследовать не позднее чем через 2 ч после взятия, при хранении на леднике – не позднее чем через 6 ч. При отправке проб воды в лабораторию оформляют сопроводительный документ, в котором указывают наименование источника, его местонахождение, дату отбора пробы (год, месяц, число и час), метеорологические условия (температуру воздуха, осадки), цель исследования воды, место службы, должность и подпись лица, направляющего пробы воды.

По ГОСТ 18963-73 для питьевой водопроводной воды, прошедшей очистку, титр кишечной палочки должен быть не ниже 300 (коли-индекс не более 3), общее количество микроорганизмов не более 100 в 1 см³.

Для воды из других источников точные нормы не установлены, но принято, что в водопроводной воде г. Москвы должно быть не более 100 микробных клеток в 1 см³, титр кишечной палочки – не менее 500 см³ (не более 2 кишечных палочек в 1 л); вода колодцев и родников может содержать не более 100 микробных клеток в 1 см³ и иметь титр кишечной палочки до 250 см³ (4 кишечные палочки в 1 л воды); вода открытых водоемов (прудов, озер) с микробным числом не более 1000, коли-титром не менее 111, коли-индексом не более 9, может применяться в пищевых производствах для технических целей (не питьевая) только после очистки и не должна иметь патогенных микроорганизмов.

Определение общего количества микробов в воде. Сущность метода заключается в определении в 1 см ³ воды общего содержания мезофильных аэробов и факультативных анаэробов при культивировании на МПА при температуре 37±0,5°С в течение 24±2 ч.

Определение начинают с приготовления разведения воды. Для этого в несколько пробирок наливают по 9 см³ стерильной воды. В первую пробирку стерильной пипеткой добавляют 1 см³ исследуемой воды. При этом пипетку не следует погружать в стерильную воду, чтобы избежать смывания микробов с поверхности пипетки. Новой стерильной пипеткой перемешивают внесенную пробу воды со стерильной водой, после чего этой же пипеткой набирают 1 см³ приготовленного разведения (1/10) и переносят во вторую (разведение 1/100), из второй в третью и т. д.

Для приготовления каждого разведения пользуются отдельной стерильной пипеткой. Чем больше загрязнена вода, тем больше готовят разведений. Из каждой пробы должен быть сделан посев не менее 2 различных объемов, выбранных с таким расчетом, чтобы на чашках выросло от 30 до 300 колоний. При использовании водопроводной воды засевают в каждую из двух чашек по 1 см³ и заливают 10…12 см³ охлажденного до 45 °С МПА.

По истечении 24 ч роста при температуре 37±0,5°С подсчитывают число выросших колоний в глубине и на поверхности агара. Если колоний выросло немного или много мелких, то считают с помощью лупы, перевернув чашку вверх дном, отмечая при этом каждую учтенную колонию чернилами или карандашом по стеклу. Если выросло большое количество колоний, то дно чашки делят на секторы и подсчет ведут в каждом отдельном секторе. При очень большом количестве выросших колоний пользуются специальной счетной камерой, которая представляет собой стеклянную пластинку, разделенную на 144 квадрата, каждый из которых равен 1 см².

Квадраты, расположенные по диагонали, в свою очередь, разделены на 9 малых квадратов каждый. Пластинка укреплена на деревянной подставке.

Определение общего количества колоний, выросших на чашке Петри, проводят следующим образом. Вначале определяют площадь чашки (π r ²). Определив площадь, помещают чашку с колониями на черное стекло или бумагу вверх дном и покрывают черной пластиной. Подсчитывают не менее 20 квадратов площадью 1 см² каждый в разных местах чашки, затем выводят среднее арифметическое число колоний на 1 см²и умножают на площадь чашки.

Результаты подсчета колоний в каждой чашке выражают в количестве бактерий на 1 см³ анализируемой воды с учетом посеянного объема. За окончательное количество бактерий принимают среднее арифметическое результата подсчета на 2 параллельных чашках или разных разведений. Результаты округляют следующим образом:

-если результат находится в пределах чисел от 1 до 100, то записывают числа, которые получены;

-если результат находится в пределах чисел от 101 до 1000, то результат округляют до 10;

-если результат находится в пределах от 1001 до 10 000, то округляют до 100 и т. д.

Количество колоний не учитывают в тех чашках, в которых при посеве из разведения выросло менее 20 или более 300 колоний, а также при сплошном росте бактерий.

Счетную пластинку рекомендуется применять при подсчете количества колоний, когда на обеих чашках отмечен ползучий рост. При этом подсчитывают квадраты на свободных от сплошного роста местах чашки.

Определение количества бактерий группы кишечных палочек в воде. Наибольшую опасность представляет фекальное загрязнение воды, так как вместе с фекалиями в воду могут попасть патогенные микроорганизмы. Обнаружить последние в воде бывает чрезвычайно трудно ввиду их небольшой концентрации, поэтому о степени загрязнения воды микроорганизмами судят по косвенным показателям – по наличию в воде кишечных палочек. К бактериям группы кишечных палочек относятся грамотрицательные, не образующие спор палочки, сбраживающие лактозу с образованием кислоты и газа при 37±0,5°С в течение 24… 18 ч или сбраживающие глюкозу с образованием кислоты и газа при 37±0,5°С в течение 24 ч и не обладающие оксидазной активностью.

Степень загрязнения воды определяется коли-титром или коли-индексом. Коли-титр показывает наименьшее количество воды, в котором обнаруживается хотя бы одна кишечная палочка, коли-индекс – число кишечных палочек в 1 л воды. Для перевода коли-индекса в коли-титр 1000 делят на число, выражающее коли-индекс.

Количество кишечных палочек в воде определяют бродильным методом и методом мембранных фильтров.

Для определения коли-индекса бродильным методом проводят посев определенных объемов анализируемой воды в среды накопления и культивирование посевов при 37±0,5°С с последующим высевом бактерий на плотную среду Эндо, дифференцирование выросших бактерий и определение наиболее вероятного числа бактерий группы кишечных палочек в 1 л воды по таблицам.

При исследовании воды на этапах очистки и обеззараживания воды открытых водоемов засевают 100,0; 10,0; 1,0 и 0,1 см³ воды. При анализе питьевой воды на выходе в водопроводную сеть и из нее засевают три объема по 100 см³, три объема по 10 см³ и три объема по 1 см³ или засевают 500 см³ в колбы (по 100 см³ в каждую) с глюкозо-пептонной или лактозо-пептонной средой с индикатором, снабженные поплавками или комочками ваты, погруженными на дно сосуда (среда Булижа или Эйкмана). Затем отмечают изменение цвета среды, наличие или отсутствие газа и помутнения. Если среда не изменилась, кишечная палочка в пробе отсутствует, исследования прекращают. Из пробирок с наличием помутнения среды и газа проводят посев на среду Эндо. Выращивают микроорганизмы при 37±0,5°С в течение 16…18 ч. При наличии характерных колоний готовят мазки, красят по Граму и ставят оксидазный тест.

Наличие активной оксидазы у всех бактерий, высеянных из колб (флаконов) или пробирок, свидетельствует об отсутствии кишечных палочек.

При росте оксидазоотрицательных, не окрашивающихся по Граму палочек засевают в полужидкую среду с глюкозой и инкубируют в течение 4...5 ч при 37±0,5°С. Наличие кислоты и газа дает основание утверждать о присутствии кишечных палочек.

В случае, если в пробирках выявляют присутствие кислоты без газа, посевы термостатируют 24 ч для окончательного учета. При наличии газа – положительный результат, при его отсутствии – отрицательный.

Можно в готовую среду Эндо добавлять 10 см³ стерильного сырого молока для учета бактерий, обладающих протеолитической активностью. Вокруг колоний бактерий, обладающих протеолитической активностью, образуются зоны просветления в результате преципитации при выпадении в осадок параказеина.

При анализе питьевой воды на выходе в водопроводную сеть и из нее коли-индекс определяют по табл. 5, 6; при оценке воды на этапах очистки и обеззараживания, воды открытых водоемов коли-индекс устанавливают по табл. 7.

При исследовании воды бродильным методом ставят оксидазный тест. Изолированные 2…3 колонии, выращенные на среде Эндо, снимают петлей и наносят штрихом на фильтровальную бумагу, смоченную реактивом для определения оксидазной активности. Если оксидазный тест отрицательный, то на участке нанесения культуры бумага не изменяет цвета; бумажка синеет в течение 1 мин, если бактерии имеют активную оксидазу.

Отсутствие оксидазы у темно-красных с металлическим блеском и без него (лактозоположительных) колоний свидетельствует о наличии бактерий группы кишечной палочки.

При обнаружении бактериального загрязнения воды свыше допустимых норм нужно проводить исследование на наличие бактерий – показателей свежего фекального загрязнения.

Свежее фекальное загрязнение в воде устанавливают, определяя наличие кишечных палочек (преимущественно Е. coli), обладающих способностью ферментировать лактозу до кислоты и газа при 43±0,5°С в присутствии ингибиторов посторонней микрофлоры.

Для определения коли-индекса методом мембранных фильтров пользуются ускоренным методом с помощью мембранных ультрафильтров (кружков диаметром 3…5 см), которые выпускаются под 5 номерами.

Сущность метода заключается в концентрировании бактерий из определенного объема анализируемой воды на мембранный фильтр, выращивании их при температуре 37±0,5°С на среде Эндо, дифференцировании выросших колоний и подсчете количества бактерий группы кишечных палочек на 1 л воды.

Чем больше размеры пор, тем выше номер фильтра и быстрее идет фильтрация. Для санитарно-бактериологического исследования воды наиболее пригоден фильтр № 3 (В.И. Тец). Матовая сторона фильтра называется воздушной. При фильтрации и посеве матовая сторона должна быть обращена вверх, а блестящая – вниз, соприкасаясь с питательной средой. Через мембранные фильтры, используя приборы Рублевского или Зейтца, фильтруют соответствующий объем среды.

Перед фильтрованием мембранные фильтры кипятят в течение 10…15 мин в дистиллированной воде, медленно нагревая и не допуская бурного кипения. Фильтровальный прибор стерилизуют обжиганием, автоклавированием или кипячением. Аппарат охлаждают, на сетку помещают простерилизованный кружок фильтровальной бумаги, смоченной стерильной водой, а затем стерильный фильтр (бумагу используют для предохранения фильтра от повреждения). По окончании фильтрования стерильным пинцетом накладывают мембранные фильтры в чашки на среду Эндо.

Поверхность фильтра с осевшими на ней бактериями должна быть обращена вверх. Под фильтром со стороны дна чашки делают надпись с указанием объема профильтрованной воды, даты посева и номера пробы. После суточного роста в термостате из характерных для кишечной палочки колоний делают мазки, окрашивают по Граму, микроскопируют.

Если на фильтрате имеются колонии, типичные для бактерий группы кишечных палочек (темно-красные, с металлическим блеском и без него, розовые, прозрачные), из нескольких колоний в мазках грамотрицательных коротких, не образующих спор палочек используют так называемый оксидазный тест. Он предназначен для дифференциации бактерий семейства Enterobacteriaceae от грамотрицательных бактерий семейства Pseudomonadaceae и других находящихся в воде сапрофитных бактерий, обладающих активной оксидазой и окисляющих фенилендиаминовые соединения до индофенола, окрашивающего колонии в ярко-синий цвет.

Для определения оксидазной активности бактерий при работе с мембранными фильтрами готовят специальный реактив: берут 30…40 мг α-нафтола, растворяют в 2,5 см³ этилового спирта, добавляют 7,5 см³ дистиллированной воды и 40…60 мг диметил- п -фенилендиамина. Раствор готовят непосредственно перед определением.

Для постановки оксидазного теста мембранный фильтр, не переворачивая, вместе с выросшими бактериями переносят пинцетом на кружок фильтровальной бумаги, обильно смоченной реактивом. По истечении 2…4 мин определяют результат.

Если произошло посинение культуры или появление синего ободка у колонии, бактерии относят к семейству Pseudomonadaceae и при анализе не учитывают.

Если не произошло изменения первоначального цвета, оксидазоотрицательные микроорганизмы относят к семейству Enterobacteriaceae. По отсутствию оксидазы у темно-красных с металлическим блеском и без него колоний грамотрицательных палочек делают заключение: наличие бактерий группы кишечных палочек доказано. Исследование воды закончено. Проводят подсчет оксидазоотрицательных колоний и вычисляют коли-индекс.

Если обнаружены на фильтрах розовые и бесцветные колонии грамотрицательных палочек с отрицательной оксидазной активностью, их подсчитывают и 2…3 изолированные колонии каждого типа высевают в полужидкую среду с глюкозой. Выдерживают в течение 4…5 ч в термостате при 37±0,5°С и затем проводят учет. Наличие кислоты и газа в полужидкой среде с глюкозой подтверждает, что эти бактерии принадлежат к группе кишечных бактерий.

Вычисляют коли-индекс. Количество бактерий группы кишечных палочек, выросших при посеве исследуемого объема воды, умножают на 1000 см ³ и делят на весь объем исследуемой воды. Например, при посеве 333 см ³ воды не выросло ни одной колонии: 1х1000:333 = 3. Следовательно, коли-индекс менее 3.

При посеве трех объемов воды по 100 см ³ на одном фильтре выросло 3 колонии бактерий группы кишечной палочки, на двух других нет роста. Коли-индекс 3х1000:300= 10.

При посеве 10 и 100 см ³ воды на одном фильтре выросла 1 колония, на другом – 5 колоний. Коли-индекс равен 6х1000:110=54.

В том случае, если на одном из фильтров обнаружен сплошной рост бактерий и подсчет их затруднен, то коли-индекс вычисляют по тому объему, в котором на фильтре выросли изолированные колонии. Например, в 100 см ³ посевного объема на фильтре сплошной рост бактерий, в объеме 10 см ³ на фильтре выросло 12 колоний бактерий кишечной палочки, коли-индекс равен: 12х1000:10=1200.

Для подтверждения свежего фекального загрязнения воды проводят дополнительно посев из колоний темно-красного цвета с металлическим блеском или без него, обнаруженных на фильтрах, в лактозную среду с борной кислотой, предварительно нагретую на водяной бане до 43±0,5°С. Затем засеянные пробирки ставят в термостат и инкубируют их при температуре 43+0,5°С в течение 24 ч.

Наличие помутнения и газа указывает на присутствие в воде бактерий – показателей свежего фекального загрязнения.

Вместо лактозной среды с борной кислотой можно использовать желточно-лактозную среду с бриллиантовым зеленым, инкубируя при 44,5+0,5°С.

Контрольные вопросы.

1. По каким критериям проводят санитарную оценку воды?

2. Какие правила необходимо соблюдать при отправке проб воды в лабораторию для бактериологического исследования?

3. Как проводится определение в воде общего количества микроорганизмов, коли-индекса?

4. Какие требования предъявляют к воде из различных источников?

Основная литература

1. Жарикова, Г.Г. Микробиология продовольственных товаров. Санитария и гигиена: учебник для вузов / Г.Г. Жарикова. – 2-е изд., стер. – М.: Издательский центр «Академия», 2007. – 304 с.

2. Нецепляев, С.В. Лабораторный практикум по микробиологии пищевых продуктов животного происхождения / С.В. Нецепляев, А.Я. Панкратов– М.: Агропромиздат, 1990. – 223 с.