Определение связанных с белком гексоз

Принцип метода: Гликопротеиды осаждают вместе с белками сыворотки или плазмы спиртом, осадок отмывают, растворяют в щелочи и определяют в нем гексозы по реакции с орцином. Количество гексоз характеризует общее содержание гликопротеидов.

Реактивы:

1. Орциновый реактив. Готовят смешиванием двух реактивов: А – серная кислота и Б – раствор орцина, 16 г/л. Реактив А готовят, осторожно добавляя к 40 мл воды 60 мл концентрированной серной кислоты. Реактив Б готовят, растворяя 1,6 г орцина в 100 мл воды. Перед определением смешивают 7,5 мл реактива А и 1 мл реактива Б.

2. 96%-ный этиловый спирт.

3. Натр едкий, 0,1 Н раствор.

4. Хлорная кислота, 0,6 моль/л, содержит 6% HCIО₄.

5. Фосфорновольфрамовая кислота, 50г/л. Готовят растворяя 5 г ее в 100 мл 2Н HCI.

6. Калибровочный раствор, содержащий 45 мг галактозы и 45 мг маннозы в 100 мл воды.

Ход определения: К 0,1 мл сыворотки или плазмы приливают 5 мл 96 %-ного спирта, перемешивают и центрифугируют 5 мин. Осадок тщательно взбалтывают в 5 мл спирта, снова центрифугируют и удаляют надосадочную жидкость. Осадок растворяют в 1 мл 0,1 NaOH, добавляют 8,5 мл орцинового реактива, перемешивают и ставят на водяную баню при 80°С на 15 мин. Охлаждают и фотометрируют в кювете с длиной оптического пути 1 см при длине волны 500 нм против холостого опыта, при постановке которого берут вместо осадка, растворенного в щелочи, воду или 0,1 Н NaOH.

Построение калибровочной кривой. 0,05-0,3 мл основного калибровочного раствора доводят водой до 1 мл, приливают 8,5 мл орцинового реактива и обрабатывают так же, как и опыт. Окраска раствора, в которой взято 0,3 мл калибровочного раствора, соответствует окраске опытной пробы, в которую взята сыворотка, содержащая 15 ммоль/л гексоз. Окраска раствора, в которую взято 0,2 мл калибровочного раствора соответствует содержанию 10 ммоль/л гексоз и т.д.