Секвенирование ДНК

Для определения нуклеотидной последовательности в ДНК были разработаны два метода:

1. Метод с использованием "минус- и плюс"-систем ("минус-плюс"-метод, метод Сенгера).

2. Метод с использованием диметилсульфата и гидразина (метод Максама-Гилберта).

Метод Сенгера заключается в получении коротких участков цепи ДНК на матрице родительской ДНК, при этом используются различные уникальные по свойствам ферменты. Сопоставление полученных фрагментов позволяет установить исходную последовательность.

Метод Максама-Гилберта построен на расщеплении фрагментов ДНК по определенным основаниям химическими агентами. Чередование этих расщеплений на однородном материале (сначала, допустим, по А, потом по Т, Г, С) позволяет получить наборы коротеньких фрагментов. Сопоставлением устанавливают общую последовательность.

Несмотря на коротенькое изложение сути методов, сами методы являются очень сложной технической процедурой. Но, все-таки, данные методы удалось автоматизировать, что позволяет довольно быстро устанавливать последовательности нуклеотидов в генах, а также привело к расшифровке генетических карт многих организмов, в том числе и человека.

Клонирование ДНК

Многие рестрицирующие нуклеазы вносят разрывы в две цепи ДНК со смещением на несколько нуклеотидов, так что на концах образуются короткие одноцепочечные участки. Эти одноцепочечные концевые участки обладают способностью образовывать комплементарные пары оснований с любым другим одноцепочечным участком, полученным с помощью того же фермента, и потому их называют липкими концами. Липкие концы, образованные рестрикционными ферментами, позволяют легко соединить два любых фрагмента ДНК воедино при условии, что эти фрагменты образовались после действия одной и той же рестрицирующей нуклеазы (рестриктазы). Таким образом, фрагмент ДНК любого происхождения можно встроить в очищенную ДНК автореплицирующегося генетического элемента, которым, как правило, является плазмида или бактериальный вирус. Исходный фрагмент может происходить прямо из геномной ДНК, или из кДНК (комплементарной ДНК), т.е. из ДНК, полученной копированием матричной РНК.