Факторов, как количество и активность включенного фермента» скорость диффузии субстрата в геле и конструкция реактора

С практической точки зрения удобен метод так называемой двойной иммобилизации, при котором в гель включается фермент, предварительно иммобилизованный путем адсорбции на твердом носителе, или же получение полимерного геля с включением фер­мента проводится в присутствии такого носителя. Приготовленный таким образом иммобилизованный препарат состоит из частиц твердого носителя, покрытых слоем ферментсодержащего гелн-Метод двойной иммобилизации сочетает преимущества твердой матрицы (большая удельная поверхность, механическая проч­ность, пористость, заданная текстура и форма частиц) и поли­мерных гелей.

Природа полимерной матрицы. Полимерные гели, применяе­мые для иммобилизации, способствуют созданию оптимального микроокружения включенного фермента, что позволяет добиться высокой каталитической активности иммобилизованных препа­ратов. Оптимизация микроокружения достигается за счет подбо­ра соответствующей гелеобразующей системы. Особенно удоб­ными с этой точки зрения являются гели на основе сополиме­ров производных акриловой кислоты. Варьируя химическую природу исходных мономеров и их соотношение, можно полу­чать полимерные матрицы с наиболее подходящими для дан­ной ферментативной реакции характеристиками. В частности, при введении в состав полимера мономерных звеньев, несущих электрический заряд, повышается каталитическая эффектив­ность иммобилизованного препарата в реакциях с участием на­ряженных субстратов. Например, скорость реакции гидролиза положительно заряженного субстрата этилового эфира a-N-бен-зоил-L-аргинина под действием трипсина, иммобилизованного в геле полиакриламида, возрастает при введении в полимерную цепь путем со поли мери заики отрицательно заряженных мономер­ных звеньев акриловой кислоты. Увеличение скорости фермента­тивной реакции объясняется повышенным сродством положи­тельно заряженного субстрата к отрицательно заряженной полимерной матрице.

Аналогичный эффект влияния полимерной матрицы на рас­пределение субстрата между гелем и окружающим его раство­ром наблюдается также в реакциях с участием гидрофобных субстратов. В этом случае увеличение каталитической эффектив­ности иммобилизованного фермента достигается при использо­вании геля, полученного путем сополимеризации с участием неполярных мономеров. Более того, применение гелей на осноне полимеров, обладающих высокой гидрофобностью, позволяет получать иммобилизованные ферментные препараты, способ­ные работать в среде неполярных органических растворителей.

Введение в полимерные цепи геля ионных групп создает вокруг включенных молекул фермента среду, обладающую бу­ферными свойствами. В результате значение рН, при котором

функционирует иммобилизованный фермент, может отличаться от рН окружающего частицу геля раствора, что на опыте прояв­ляется в виде сдвига наблюдаемого рН-оптимум а ферментатив­ной реакции. Таким образом, варьируя содержание в геле за­ряженных групп, можно создать вблизи, фермента наиболее благоприятное для него значение рН, не меняя рН внешнего раствора.

Более подробно эффекты микросреды (влияние заряда, гидрофобности носителя и т. п.) в катализе иммобилизован­ными ферментами рассмотрены в гл. IV.

§10. Преимущества и недостатки иммобилизации ферментов путем включения в гель

Способ иммобилизации ферментов путем включения 8 поли­мерный гель отличается простотой применяемых методик, поз­воляет создавать иммобилизованные препараты любой геомет­рической конфигурации (сферические частицы, пленки н т. п.), обеспечивая при этом равномерное распределение би о катализа­тора в объеме носителя. Многие полимерные гели обладают высокой химической, механической и тепловой стойкостью, что дает возможность многократного использования иммобилизован­ных препаратов на их основе- Метод универсален, поскольку применим для иммобилизации практически любых ферментов» а также полиферментных систем, клеточных фрагментов и даже клеток. Важное преимущество метода состоит в том, что во многих случаях иммобилизация в геле приводит к значитель­ной стабилизации ферментов. Наконец, фермент, включенный в гель, надежно защищен от инактивации вследствие бактериаль­ного заражения, поскольку крупные клетки бактерий не могут проникнуть в мелкопористую полимерную матрицу.

Основным недостатком этого метода является то, что поли­мерная матрица создает значительные препятствия для диффу­зии субстрата к ферменту, снижая каталитическую эффектив­ность иммобилизованного препарата. Если в роли субстрата выступает высокомолекулярное соединение, то этот способ им­мобилизации вообще неприменим.