Кинетические параметры ферментативных реакций

В простейшем случае скорость (v) катализируемой фермен­том реакцни анализируется в рамках уравнения Михаэлиса— Ментен;

где [£]о и [S]o — концентрация фермента и субстрата в системе соответственно; к^т — каталитическая конгтантз ферментатив­ной реакции; /С_Млаж — определяемое эффективное (кажущееся) значение константы Михаэлиса.

Параметр Лм_язж служит характеристикой сродства фермента к субстрату н_т следовательно, является мерой той концентрации субстрата, которая необходима для насыщения фермента. При катализе иммобилизованными ферментами концентрация суб­страта вблизи фермента (локальная) может отличаться от кон­центрации субстрата во всем объеме системы. В этом случае на­блюдаемая на опыте Кп.каж должна зависеть от распределения субстрата-между свободным раствором и носителем, где сосре­доточен фермент. Что касается параметра ^„_ат1 то он характе­ризует реакционную способность уже образовавшегося фер­мент—субстратного комплекса, поэтому не зависит от распреде­ления субстрата в системе, а определяется состоянием, в первую очередь, конформици^й самого фермента.

Каталитические параметры ферментативной реакции (ft_raT и Км.каж) могут зависеть от наличия в реакционной системе раз* личных эффекторов, таких, как ингибиторы и активаторы, ионы водорода и т. п. В таких случаях необходимо учитывать рас­пределение также этих эффекторов между раствором и фермент-содержащей матрицей.

Таким образом, все кинетические эффекты, наблюдаемые при катализе иммобилизованными ферментами, можно разделить на две группы. К первой из них относятся эффекты, связанные с влиянием иммобилизации на состояние (конформацию) фермен­та, а ко второй — эффекты, обусловленные распределением реа­гентов в системе.

§ 2. Влияние иммобилизации на состояние фермента

Информационные свойства иммобилизованных ферментов. При иммобилизации существует опасность, что белок присоеди­нится к носителю в конформацни, отличной от нативной. В этом случае каталитическая активность фермента может существенно измениться или вообще исчезнуть.

Вопрос о том, произошли ли в белке конформационные из­менения при иммобилизации, решается исследованием структург>1 иммобилизован мы к ферментов физическими методами. Для этой цели с успехом использовали оптические методы (спектрофото-метрическии, флуоресцентный), метол спиновых меток и др. Анализируя данные этих исследований, можно сделать следую­щие выводы.

1. В результате иммобилизации пространственная структура фермента может либо существенно измениться, либо изме­ниться незначительно, либо остаться неизменной (что наблюда­ется чаще всего).

2. В тех случаях, когда конформация нативного и иммобилизо-

ванного ферментов различается, это обусловлено одной из трех причин. Во-перных, конформационпые различия могут быть обусловлены химической модификацией каких-либо важных д^я структуры функциональных групп белка и не связаны с самим процессом иммобилизации фермента (т. е. его присоединением к носителю). Чтобы устранить действие этого фактора, необхо­димо выбрать соответствующий метод иммобилизации не затра­гивающий этих функциональных групп в белке. Кроме того» часто фермент удается защитить от инактивации на стадии иммобилизации простым добавлением субстрата или другого специфического л и ганда в насыщающей концентрации, что поз­воляет получать препараты с более высокой удельной каталити­ческой активностью (т, е. активностью» отнесенной к I r носи-теля}-

Во-вторых, причиной искажения структуры фермента могут быть неспецифические взаимодействия (электростатические, гидрофобные, водородные связи) между ферментом и носителем, приводящие к денатурации. Чтобы избежать этих взаимодей­ствий, иногда достаточно заменить носитель на инертный по отношению к белку. Такой инертностью обычно обладают поли-сахаридные носители, пол и акрил амид и некоторые другие. Если замена носителя по какой-либо причине нежелательна, то исполь­зуют следующий методический прием: отдаляют белковые моле­кулы от поверхности носителя за счет увеличения длины «ножки» (сшивающего агента). При этом, как правило, удается ослабить неблагоприятное для фермента воздействие носителя.

И наконец, третьей возможной причиной различия структур нативного и иммобилизованного ферментов может быть большое число связей между ферментом и носителем.

3, В принципе может реализоваться такая ситуация, когда в результате иммобилизации конформация фермента практически не изменяется, но нарушается динамика конформационных изменений в белке. Так, у белков, связанных с носителями, могут замедляться необходимые для катализа кенформационные переходы, уменьшаться число конформационных стадий и глубина их протекания. Причиной этого являются неспецифиче­ские взаимодействия функциональных групп белка с носителем. Чтобы избежать их, необходимо, как показывает практика, про­водить иммобилизацию на инертных носителях.

Фиксация «напряженных» состояний фермента. Иногда исследователи целенаправленно стремятся «закрепить» с по­мощью иммобилизации конформацию фермента, отличающуюся от нативной. Это, в частности, оказывается важным для детек­ции конформационных изменений в ферментах, индуцированных субстратами, кофакторами и другими специфическими ли ган­да ми,

: Рассмотрим» как это делается (рис. Н). Комплекс фермента с субстратом или другим специфическим лигандом_t образующий­ся в присутствии насыщающих концентраций этого лиганда,

E-S

Рис, 14, Схематическое изображение фиксации с помощью иммо­билизации «напряженной» конформации бедна,

сшивают бифунциональными агентами (стадия а на рис. 14) или присоединяют к предварительно активированному носителю (стадия б на рис. 14). После удаления лнгаида фермент оста­ется зафиксированным в «напряженной» конформации.

Как показали многочисленные исследования, «замороженные» конформации фермента могут отличаться от обычных, ненапря­женных состояний, реализуемых в тех случаях, когда иммоби­лизацию проводят в отсутствие специфических лигандов, ло це­лому ряду свойств: стабильности, доступности к действию моди­фицирующих агентов» сродству к субстрату и специфическим лигандам, а также каталитическим свойствам. Этот фактор необходимо учитывать, поскольку иммобилизацию фермента иногда рекомендуют проводить в присутствии специфических лнгандов с целью большей сохранности ферментативной ак­тивности.

§ 3. Эффекты распредепения реагентов в катализе иммобилизованными ферментами

Распределение субстрата, Б условиях равновесного распре­деления субстрата между раствором н ферментсодержащей матрицей Км.мж» входящая в уравнение (I), определяется сле­дующим выражением:

JW™ = К_МЯ, (2)

где Хм — значение константы Михаэлиса реакции, катализи­руемой свободным (нейммобилизованным) ферментом; Р — коэф~ фнциент распределения субстрата > который задается формулой

(3)

где [S]^p и \S]^H — концентрации субстрата в растворе и в матрице носителя соответственно.

Из уравнения (1) следует, что при высоких концентрациях субстрата (|5|»Км.*«ж) эффекты распределения не играют существенной роли, поскольку в этом случае скорость фермента­тивной реакции У = й_кат[£], т. е. не зависит от концентрации субстрата. Если же концентрация субстрата невелика ([5]<A_W(seHt), то анализ уравнений (I) —(3) показывает, что концентрирование субстрата в матрице (Р<:1) приводит к уменьшению значения /См,***, т. е. к возрастанию скорости ферментативной реакции. В тех же случаях, когда Р>1, скорость ферментативной реакции падает вследствие возрастания Ям.квж.

Неравномерность распределения субстрата в системе обус­ловлена его взаимодействием с матрицей за счет, например, электростатических сил, водородных связей, гидрофобных взаи­модействий н т. п. В случае электростатических взаимодействий установлена количественная взаимосвязь между коэффициентом распределения Р н характеристиками субстрата и матрицы:

^*), (4)

где е — единичный заряд электрона; Z — заряд субстрата, кратный заряду электрона; ^ — электростатический потенциал носителя; k константа Больцмана; Т — абсолютная темпе­ратура.

В заключение отметим, что в случае тех ферментов, которые характеризуются низким сродством к субстрату (высокое зна­чение Км) или действуют на плохо растворимые субстраты (предел растворимости субстрата ниже значения Кил)> выбор носителя для иммобилизации приобретает первостепенное зна­чение. В этих случаях, подобрав носитель, для которого коэф­фициент Pj>U можно добиться существенного увеличения скоро­сти ферментативной реакции [см. уравнения (1) — (3)].

Диффузионные ограничении в катализе иммобилизованными ферментами. Если молекула фермента находится на поверхности (или внутри) частицы носителя, то для протекания ферментатив­ной реакции необходимо, во-первых, чтобы молекула субстрата подошла к поверхности частицы, и, во-вторых, продиффундиро-вала внутрь нее. В зависимости от того, как соотносятся скорости диффузионных стадий и непосредственно ферментативной реакции, может реализоваться одна из трех нижеперечисленных ситуаций.

Если ферментативная реакция в поверхностных слоях час­тицы протекает быстрее, чем субстрат из раствора подходит к поверхности, то через непродолжительное время вокруг части­цы образуется зона, обедненная субстратом. В результате наблюдаемая скорость ферментативной реакции будет опреде­ляться скоростью массопереноса субстрата к частице. В этом случае говорят, что процесс контролируется внешней диффу­зией.

Если массоперенос субстрата проходит быстрее, чем идет ферментативная реакция на поверхности частицы» то может возникнуть другой тип диффузионных затруднений. А именно, если размер частицы носителя велик» а фермент очень активен (или велика его плотность внутри частицы), то практически весь субстрат израсходуется уже в приповерхностных слоях носителя, а глубинные области будут обеднены субстратом. В таком случае говорят» что процесс контролируется внутренней диффузией.

И наконец, когда диффузия субстрата как к поверхностному слою, так и во внутренние области частицы проходит достаточно быстро, общая скорость превращения субстрата определяется непосредственно ферментативной реакцией. В этом случае гово­рят о кинетически контролируемом процессе.

Учет диффузионных факторов является одним из наиболее сложных вопросов в катализе иммобилизованными ферментами. В рамках уравнения Михаэлнса—Ментен [уравнение (l)J будет проанализировано влияние диффузионных факторов на эффек­тивные кинетические параметры ферментативной реакции.

Внешнедиффузионное торможение. К поверхности частицы носителя примыкает неперемешиваемыи слой жидкости, в преде­лах которого перенос молекул происходит исключительно за счет молекулярной диффузии. Поскольку молекулярная диффу­зия в жидкостях проходит очень медленно {с коэффициентом диффузии 10~^s—IO^cmVc), массоперенос может стать лимити­рующей стадиен процесса, катализируемого иммобилизованным ферментом.

Согласно первому закону Фика диффузионная скорость по­дачи субстрата /, отнесенная к единице площади поверхности частицы носителя, пропорциональна градиенту концентрации субстрата, При наиболее часто распространенном случае линей­ного градиента концентрации

(5)

где р — коэффициент массо пере носа; So и 5 — концентрации субстрата в растворе и в частице с иммобилизованным фермен­том соответственно.

При достижении стационарного состояния в системе, т. е. когда скорость диффузионного потока субстрата равна скорости его расходования в ферментативной реакции, справедливо сле­дующее уравнение:

где буквенные символы обозначают те же параметры системы, что и в уравнениях (I) — (5).

Проанализируем частные случаи уравнения (6). В условиях насыщения фермента субстратом (Km, *_aw <£; [ S]) кинетика фер­ментативной реакции описывается нулевым порядком по кои-

центрами и субстрата и ферментативный процесс не может лими­тироваться диффузией, т. е. всегда протекает в кинетическом режиме,

В случае, когда /См._каж 2>[S|. т. е. когда кинетика фермен­тативной реакции подчиняется уравнению первого порядка, имеем следующее выражение для стационарной скорости фер­ментативной реакции:

Анализ выражения (7) показывает, что возможны два край­них случая. Если р >• k_K&t\ Щ/Км.ыж, т. е. массоперенос осу­ществляется намного быстрее, чем идет ферментативная реак-

цня, то v — "^aTl ' [So]. В этом случае реакция проходит в ки-

1\(Л кгж

нетическом режиме. Если же ферментативная реакция идет на­много быстрее массопереноса, т. е. Э <£ кьат{Е]/Кгл.*а»., то ч-= р[5] и ферментативный процесс протекает в диффузионном режиме.

В общем случае, когда К(л,*аж ~|S], т. е. кинетика фермен­тативной реакции характеризуется дробным порядком по суб­страту, несмотря на существенно более громоздкие выражения, по-прежнему справедлив вывод о двух режимах протекания ферментативного процесса - - кинетическом и диффузионном.

Можно ли решить заранее, в каком режиме, кинетическом или диффузионном, будет протекать ферментативная реакция? Для этого прежде всего необходимо оценить параметр р. Срав­нив его со значением 1ь*ят[Е\/Кн,кяж, можно, в принципе, сде­лать вывод о режиме (кинетическом или диффузионном) про­текания ферментативной реакции [см. уравнение (6)].