2015-09-06
445
Анаеробний розклад вуглеводів під дією мікроорганізмів на етиловий спирт та вуглекислий газ називається спиртовим бродінням. Головний кінцевий продукт бродіння – етиловий спирт:
С6Н12О6 → СН3СН2ОН + 2СО2+28,2 ккал
Проміжними продуктами бродіння є фосфорногліцеринова, піровиноградна кислоти, оцтовий альдегід, а побічними – гліцерин, янтарна кислота та сивушні масла (аміловий, ізоаміловий, бутиловий, ізобутиловий та інші спирти).
Збудниками спиртового бродіння є культурні (p. Saccharоmyces) і дикі (p. Torula) дріжджі, деякі плісняві гриби (р. Мисоr) і бактерії (р. Pseudomonas).
На Україні використовуються культурні дріжджі, які відібрані селекційними методами за позитивними для виробництва якостями. Клітини їх овальної форми, розміром 8–10 мкм. Розмножуються переважно брунькуванням, але можуть у несприятливих умовах утворювати спори. Широко поширені в природі дикі дріжджі – в ґрунтах і на поверхні рослин. Характерною ознакою для них є пігментація клітин (рожеві, зелені, чорні), яка захищає їх від сонячної інсоляції. Дріжджі роду Saccharоmyces міцелій не утворюють, а представники роду Torula мають зачатковий міцелій. Більшість дріжджів – сапрофіти, окремі види спричиняють псування харчових продуктів і захворювання людини (кандідози). Дріжджі, які викликають спиртове бродіння, поділяються на дві групи (раси).
Верхові дріжджі ростуть при підвищеній температурі (18–30°С). Бродіння супроводжується пишним і бурхливим виділенням вуглекислого газу та піни, помутнінням субстрату й утворенням пухкого осаду на дні. Ці дріжджі використовуються у хлібопеченні і виготовленні шампанських вин. Характерний представник Saccharomyces cerevisia.
Низові дріжджі можуть жити при низьких температурах (4–15°С). Низове бродіння відбувається спокійно, без бурхливого газоутворення, дріжджі не викликають помутніння субстрату, після закінчення бродіння легко випадають на дно, утворюючи щільний осад. Ці дріжджі використовують у пивоварінні і виноробстві. Представник – Saccharomyces vini.
Спиртове бродіння нормально відбувається в кислому середовищі при рН 4,0–4,5.
Клітини дріжджів мають повний набір дихальних ферментів і добре ростуть в аеробних умовах, утворюючи велику кількість біомаси. Їх використовують для одержання кормового білка (вирощують дріжджі з доступом кисню на мелясі, відходах целюлозної та нафтової промисловості, метанолі, етанолі). Дріжджі використовують також для одержання жирів (типу рослинної олії). Вони постачають нас вітамінами групи В. Методами генної інженерії дріжджам надають нові якості – вони починають продукувати біологічно активні речовини (інтерферон та інші), які використовуються як цінні медичні препарати.
Під час молочнокислого бродіння відбувається розклад вуглеводів в анаеробних умовах з утворенням молочної кислоти. Серед побічних продуктів утворюються оцтова кислота, вуглекислий газ, інколи етиловий спирт.
Молочнокислі бактерії, які здійснюють цей процес, за формою – палички і коки. Це грампозитивні мікроорганізми, спор не утворюють, переважно нерухомі, факультативні анаероби. Особливістю даної групи бактерій є слабкість їх біосинтетичних можливостей. Вони не здатні до синтезу, тому залежать від присутності у середовищі багатьох речовин: усіх амінокислот, вітамінів групи В, компонентів нуклеїнових кислот. Молочнокислі бактерії широко розповсюджені в природі, зустрічаються на поверхні рослин, у ґрунті, в кишковому тракті людини й тварин і, насамперед, у молоці та молочнокислих продуктах. За характером бродіння, яке вони викликають, виділяють такі групи:
Гомоферментативні, або типові бактерії – утворюють переважно одну молочну кислоту, яка становить 90 % усіх продуктів бродіння:
С6Н12О6 → 2СН3СНОНСООН + СО2 + 94,3 кДж
Збудниками гомоферментативного бродіння є: Streptococcus lactis – молочнокислий стрептокок, клітини в якому розташовані у вигляді диплококів та коротеньких ланцюжків, викликає закисання молока; Lactobacterium bulgaricum – болгарська паличка використовується для виготовлення кислого молока; Lactobacterium cucumeris – огіркова паличка, утворює ланцюжки, бере участь у квашенні огірків; Lactobacterium plantarum – бере участь у квашенні овочів і силосуванні кормів; Lactobacterium casei – відіграє роль при дозріванні сирів; Lactobacterium acidophilus – використовується для виготовлення ацидофіліна.
Гетероферментативні, або нетипові бактерії – утворюють з вуглеводів, крім молочної, значну кількість оцтової кислоти, вуглекислий газ, етиловий спирт і гліцерин:
С6Н12О6 → СН3СНОНСООН+ СН3СООН+ СН2ОНСНОНСН2ОН+ СН3СН2ОН +СО2
До збудників гетероферментативного молочнокислого бродіння належать Lactobacterium brassica – капустяна паличка, Betabacterium brevis. Вони зустрічаються на рослинах та у хлібних заквасках.
Біфідобактерії мають вигляд прямих або розгалужених паличок, У-подібної форми, булавовидні та лопатовидні, нерухомі, безспорові, грампозитивні. Типовий представник – Bacterium bifidum. Біфідобактерії живуть у кишковому тракті людини, тварин та комах. Вони синтезують антибіотики, з чистих культур готують лікувальний молочнокислий біфідін.
Молочнокислі бактерії використовують для виготовлення кисломолочних продуктів, сирів, для квашення овочів і силосування; у промисловості – для одержання молочної кислоти.
Кисломолочні продукти бувають двох типів:
1) простого бродіння – кисле молоко, сметана, ацидофілія, ряжанка;
2) змішаного бродіння – кефір та кумис.
Кефір виготовляють за допомогою кефірних зерен, які є симбіотичним комплексом молочнокислих бактерій та дріжджів, а кумис – за допомогою заквасок, які також складаються з молочнокислих бактерій та дріжджів.
Порядок виконання роботи:
1. Вивчити збудників спиртового бродіння.
Приготувати мазок з культури дріжджів, висушити, зафіксувати його, пофарбувати фуксином 2 хвилини, промити водою, висушити, подивитись під мікроскопом на об'єктиві 90х з імерсією, замалювати в зошит.
2. Провести якісну реакцію на етиловий спирт.
До 3−4 мл бражки додають 2−3 краплі концентрованої сірчаної кислоти й крапають 1 %-й біхромата калію до переходу оранжевого кольору в синьо-зелений за рахунок взаємодії біхромата калію і сірчаної кислоти з етиловим спиртом.
3. Вивчити збудників молочнокислого бродіння.
Молочнокисле бродіння викликають молочнокислі бактерії, котрі за морфологічними ознаками розподіляються на молочнокислі палочки та молочнокислі стрептококи. Для виділення останніх застосовують метод збагачення.
Свіже молоко наливають в 1−2 стерильні пробірки по 5−6 мл і залишають при t = 30°С для розвитку бактерій. Чергові три пробірки з молоком заражають сметаною, сиром, кефіром і культивують 24 години при t = 30°С. Потім готують мазки із сироватки молока, що зсілося, з усіх пробірок. Препарати сушать, фіксують у полум’ї пальника. Жир знімають, накладаючи фільтрувальний папір на гарячий мазок. Мазок підфарбовують метиленовою синькою (фарбник добре забарвлює мікроби і погано – казеїн молока), мікроскопують і замальовують.
Для виділення чистої культури бактеріальною петлею молоко, що зсілося, з одібраних пробірок переносять у пробірку з 10 мл стерильного фізіологічного розчину, ретельно розмішують, потім висівають із пробірок по одній петлі в МПА з 2 % цукру, останній виливають у чашки Петрі. Через дві доби при t = 30°С на агарі виростають дрібні колонії: поверхні – округлі, краплини близько 1 мм у діаметрі та глибині – у вигляді черевичок. Форму колоній розглядають у бінокулярний мікроскоп і замальовують.
Із 4−5 ізольованих колоній роблять посів у пробірки із стерильним молоком. Посіви вирощують при t = 30°С. З пробірок, які містять молоко, готують і продивляються препарати. Чисті культури повинні містити однорідні диплококи, короткі ланцюжки або палички.
4. Провести якісні реакції на виявлення молочної кислоти.
Молочна кислота в кислому середовищі при температурі кипіння окислюється КМgО4 в оцтовий альдегід, який з аміачним розчином срібла дає характерну реакцію срібного “дзеркала”.
Молочнокислий затір звільняють від осаду за допомогою паперового фільтра або центрифуги. Супернатант у об’ємі 5−7 мл вміщують в 50 мл колбу, додають 1 мл 10 % розчину сірчаної кислоти і нагрівають до кипіння. Додають краплями 2%-ний розчин КМgО4 Молочна кислота перетворюється на оцтовий альдегід. Останній виявляють за допомогою фільтрувального паперу, змоченого аміачним розчином азотного срібла. Таким папером накривають колбу з супернатантом. Внаслідок дії оцтового альдегіду на аміачний розчин срібла папір чорніє.
Для приготування аміачного розчину AgNО3 у пробірку вміщують 1−2 мл 10%-ного розчину азотнокислого срібла і додають по краплі аміак. Спочатку з’являється бура муть (Ag2О), котра потім розчиняється в NН3 Цим розчином і змочують папір.
Результати роботи оформити у вигляді звіту.
