Мінеральне живлення

Макроелементи. Азот. Рослинні тканини, що ростуть в ізольованій культурі, автотрофи у відношенні азотного живлення. Із неорганічного азоту вони синтезують всі необхідні для їх життєдіяльності органічні азотисті сполуки. Джерелами молекулярного азоту є мінеральні солі, амінокислоти.

Кращою формою азотного живлення рослинних тканин є нітрати, які як основне джерело азоту вводяться у середовища у концентраціях 2-25 мМ. Спроби використати джерелом азоту нітрити показали, що вони не могли замінити нітрати: низькі концентрації нітритів були недостатні для оптимального росту рослинних тканин, а великі - токсичні. Кращі результати, ніж при використанні нітритів, отримують при застосуванні, в якості джерела азоту, амонійних солей. Однак, амоній значно менш ефективний як джерело азоту ніж нітрати. Проте, заміна 10-20% нітратів на солі амонію покращує ріст рослинних тканин. Так до складу середовища Гамборга, на якому добре ростуть дводольні і однодольні рослини, крім нітрату (25 мМ) входять і амонійні солі (2 мМ). У деяких випадках для інтенсивного росту калюсних і суспензійних культур сумарну концентрацію нітрату і аміаку доцільно збільшити до 60 мМ.

Азот живильного середовища впливає на морфогенетичні можливості тканини: залежно від нітратної чи амонійної форми азоту індукуються пагони або корені, бруньки або ембріоїди.

При культивуванні рослинних тканин як єдине джерело азоту можна використовувати амінокислоти в L -конформації. Але для більшості культур тканин одна амінокислота або навіть їхня суміш неефективні як єдине джерело азоту, бо ріст цих культур значно повільніший, ніж на середовищах з нітратами. Це може бути обумовлене тим, що амінокислоти не завжди можуть активно дезамінуватися або аміак, що утворився, не може бути використаним для синтезу первинних продуктів. Другою причиною може бути потреба в самих нітратах, оскільки деякі проміжні сполуки відновлення нітратів беруть участь в біосинтезі важливих азотистих метаболітів. Слід зазначити, що ріст ряду ізольованих рослинних тканин активується при введені до складу нітратвмісного середовища окремих амінокислот, найчастіше гліцину, або їхніх сумішей, наприклад, гідролізат казеїну, пектон.

Сірку вводять до складу живильних середовищ у вигляді сульфату, сульфіту, цистеїну, глутатіону або метіоніну. Для більшості тканин найкращим джерелом сірки є сульфати.

Для росту калюсних тканин і ізольованих органів необхідним компонентом середовищ є фосфор. Тканини, які інтенсивно ростуть, особливо чутливі до вмісту фосфору у живильному середовищі і краще ростуть на середовищах багатих фосфором. Як джерело фосфорного живлення, в основному, використовується ортофосфат, але можна використовувати різні фосфати цукрів.

Залізо вводиться у вигляді неорганічних солей (FeCl₃, Fe₂(SO₄)₃) і солей органічних кислот (цитрат і тартрат заліза). Але метаболіти, які виділяють культури тканин, і рН середовища впливають на засвоєння заліза рослинними тканинами. Тому більшість середовищ містять цей елемент в хелатованій формі у комплексі з етилендіамінтетраоцтовою кислотою (ЕДТА). Це покращує доступність заліза при рН до 8,0 впродовж всього періоду росту культури, тоді як відсутність хелатуючого агента може дуже швидко призвести до нестачі його.

Потреба тканини в елементах мінерального живлення залежить від її фізіологічних особливостей. Для молодих швидкоростучих тканин, необхідна наявність у середовищі високих доз калію (К⁺), тоді як старі тканини, навпаки, вибагливі до наявності кальцію (Са²⁺). Так, оптимальна доза кальцію для молодої тканини моркви – 0,25 мМ, для старої тканини ця доза підвищується до 3 мМ.

При відсутності у середовищі калію (К⁺) уже в першому пасажі культури тканин моркви спостерігається пригнічення росту і некрози; у другому пасажі на такому живильному середовищі ріст припиняється і тканина відмирає. Однак перенесення на середовище, яке нормально забезпечене калієм (К⁺), поновлює ріст тканини моркви, навіть якщо перед цим її вирощували на середовищі без калію (К⁺) впродовж двох пасажів.

В результаті ретельного вивчення мінерального живлення ізольованих рослинних тканин дослідники дійшли висновку, що відсутність у живильному середовищі N, K, Ca, Mg, S, P призводить до загибелі культури у першому або у другому пасажі. Наявність Na⁺ і Cl^- не обов’язкова, хоча додавання NaCl в середовище стимулює ріст рослинних тканин. Для більшості елементів існує оптимум концентрації, але його перевищення інколи має токсичну дію.

Крім макроелементів до складу більшості живильних середовищ входять мікроелементи. Додавання до живильного середовища мікроелементів особливо важливе при культивуванні тканин в рідкому середовищі. Відсутність мікроелементів зменшує інтенсивність росту культур на 40 % у першому пасажі і приводить культури до загибелі протягом двох наступних.

При вирощуванні тканин на агаровому живильному середовищі вони не так гостро реагують на відсутність мікроелементів, так як в агарі міститься багато мікроелементів і деякі макроелементи. Однак повнота вмісту мікроелементів в агарі викликає сумніви, а тому більшість дослідників додають повну суміш мікроелементів і до агарових середовищ. Найчастіше використовують суміш мікроелементів середовища Мурасиге і Скуга (МС).

Мікроелементи необхідні для функціонування ферментів та кофакторів.

Вуглеводневе живлення

Культури тканин, навіть ті, що зеленіють на світлі не автотрофні відносно вуглеводневого живлення. При ізолюванні і перенесенні на живильне середовище шматочків хлорофілоносних тканин, вони, як правило, втрачають хлорофіл. При вирощуванні на світлі одні тканини позбавляються хлорофілу (тканина серцевинної паренхіми тютюну), інші тканини на світлі зеленіють (тканини моркви, барвінку рожевого), але не здатні забезпечити себе повністю вуглеводами за рахунок фотосинтезу, і їх необхідно вирощувати на живильних середовищах, які містять вуглеводи.

Найкращим джерелом вуглеводневого живлення для більшості рослинних тканин є сахароза або глюкоза, звичайно у концентрації 2 – 5 %. Але для деяких тканин оптимальними джерелами вуглецю слугують фруктоза, маноза або галактоза. На середовищах з пентозами ізольовані тканини рослин не ростуть, за виключенням ксилози, яка є хорошим джерелом вуглецю для тканини моркви.

Полісахариди, як правило, не використовують як джерело вуглеводневого живлення при вирощуванні культур рослинних тканин. Але, оскільки, деякі тканини здатні виділяти у середовище гідролітичні ферменти, наприклад, амілазу, то вони можуть рости на середовищах з розчинним крохмалем. Здатністю засвоювати полісахариди часто характеризуються тканини деревних рослин, а також тканини пухлинного походження.

Часто оптимальною умовою для росту тканини є наявність в середовищі різних цукрів. Так для підтримання росту тканини топінамбура оптимальною є суміш 0,1 М сахарози та 0,11 М глюкози.

Р.Бутенко із співробітниками отримали цікаві дані щодо характеру росту тканини партеноцисуса на середовищі з глюкозою і сахарозою: якщо на середовищі з глюкозою тканина росла на поверхні агару і розсипалась на окремі шматочки, то на середовищі з сахарозою тканина більш інтенсивно росла у висоту і утворювала загальну компактну масу.

Необхідно особливо відмітити вплив умов стерилізації на дію цукрів. Рядом дослідників було показано, що при автоклавуванні середовища з сахарозою або глюкозою, які спеціально не очищали, відбувається утворення речовин, які стимулюють ріст рослинних тканин.

Досліди по використанню джерелами вуглеводневого живлення спиртів або органічних кислот показали, що із спиртів тканини можуть використовувати лише гліцерин, а органічні кислоти використовуються погано. Хоча як доповнення до середовища з цукром органічні кислоти у низьких концентраціях (0,015 – 0,125 %) стимулюють ріст тканин. Найбільшу стимулюючу дію мали трикарбонові кислоти циклу Кребса.