Фітогормони

Для росту і диференціації будь-яких рослинних клітин необхідні ауксини і цитокініни. Оскільки різні клітини і тканини в культурі відрізняються за здатністю до автономного синтезу і метаболізму окремих груп фітогормонів, то у зв’язку з цим їхній ріст у різній мірі залежить від забезпечення екзогенними регуляторами росту.

За відмінністю в потребі в екзогенних ауксинах і цитокінінах виділяють кілька груп тканин:

1. тканини, які ростуть на середовищах з ауксинами;

2. тканини, для росту яких у складі середовища потрібні тільки цитокініни;

3. тканини, для росту яких необхідні ауксини і цитокініни.

До першої групи тканин належать експлантати бульби топінамбура, коренів цикорію і скорцени. Ріст тканини топінамбура прямо пропорційний від’ємному логарифму концентрації ауксину в середовищі, у зв’язку з цим ця тканина використовується для дослідження ауксинової активності природних рослинних екстрактів або нових синтезованих сполук.

Тканин, які ростуть при наявності в середовищі цитокініну, не багато. До них належать культура кінчика кореня турнепса і сім’ядолей сої. Тканину сої використовують для дослідження цитокінінової активності.

Найчисельнішою є третя група тканин, для росту яких в умовах in vitro в середовищі необхідні і ауксини, і цитокініни.

Із ауксинів для отримання і підтримання культури тканин найбільше використовуються β–індолілоцтова кислота (ІОК), α–нафтилоцтова кислота (НОК) і 2,4–дихлорфеноксіоцтова кислота (2,4-Д) у концентраціях 1–30 ^мг/_л, 0,1–2 ^мг/_л, 1 ^мг/_л відповідно.

Для індукції калюсоутворення звичайно використовують 2,4-Д, яка у 300 разів активніша ніж ІОК і у 10 разів активніша ніж НОК.

Для індукції калюсоутворення звичайно використовують високі концентрації ауксинів, а при послідуючих пересадках тканина може рости при вмісті ауксинів у 10 разів меншому.

Для отримання калюсних культур дводольних рослин в середовища додається ІОК в концентраціях 1–10 ^мг/_л. При послідуючих пересадках концентрацію зменшують до 0,1–0,05 ^мг/_л.

Для отримання калюсу однодольних рослин використовуються досить високі дози 2,4–Д – 2–10 ^мг/_л. Винятком є тканина ендосперму кукурудзи, яка здатна до автономного синтезу ауксину і росте на середовищі без регуляторів росту.

Цитокініни, а саме кінетин, були відкриті Скугом при вивченні росту калюсу тютюну. Встановлено, що він не тільки активує клітинні поділи, але є обов’язковим компонентом індукування органогенезу. Кінетин значно підвищує ріст багатьох калюсних культур, наприклад моркви, сої, топінамбура. Кінетин вводиться в середовище у концентраціях 0,001–10 ^мг/_л.

Крім кінетину для культивування ізольованих рослинних тканин використовують і інші цитокініни, зокрема, бензиламінопурин (БАП) і зеатин, які мають більш високу активність підтримки росту та індукції органогенезу. Є дані, що високі концентрації кінетину (0,1 – 1 ^мг/_л) можуть забезпечити ріст ауксиннезалежних калюсних тканин.

Цитокініни разом з ауксинами беруть участь в процесах органогенезу у рослин. Для закладення у калюсі коренів або пагонів необхідні певні концентрації і співвідношення цитокініну і ауксину (Рис. 1).

Рис.1. Схема спільної дії ІОК та кінетину на органогенез калюсу тютюну.

Для диференціації коренів у калюсі тютюну необхідно 2 ^мг/_л ІОК і 0,02 ^мг/_л кінетину (100:1). Підвищення концентрації кінетину до 0,5 – 1 ^мг/_л індукує формування стеблових бруньок. Таким чином, зміщення співвідношення концентрацій ауксин-цитокінін в бік цитокініну сприяє утворенню стеблових бруньок, а в бік ауксину – закладанню коренів. Однак, як правило, і для індукції коренеутворення необхідна наявність цитокініну в низьких концентраціях.

Таким чином, ауксини додають для індукції клітинного поділу і диференціації; вони активують утворення коренів, регулюють регенерацію пагона. Цитокініни активують і прискорюють процес дедиференціації, клітинного поділу, калюсоутворення, активують диференціацію стеблових бруньок.

Гібереліни, як правило, не є необхідними для росту клітин у культурі, але Стюард і Стріт (1971) вказують, що при низький густині клітин явора у суспензії гібереліни необхідні. Крім цього гібереліни активують ріст і витягування стебла, тобто сприяють отриманню рослин з потужною надземною частиною.

Рослинні екстракти

Для індукції первинного калюсу і рідше для підтримки його росту іноді до живильного середовища додають рослинні екстракти або соки певного складу, які мають рістактивуючі властивості. Серед них: кокосове молоко, ендосперм рослин, солодовий та дріжджовий екстракти, березовий сік і пасока інших рослин, кукурудзяний екстракт, томатний та апельсиновий сік, екстракти із стебел і листків, екстракти із пухлинних тканин.

АГАР

При вирощуванні тканин найбільш поширеним способом на твердому живильному середовищі звичайно використовують агар у концентраціях 6-10 г/л. Желатинові живильні середовища не придатні для культури, так як желатина токсична для тканин рослин.

Агар– це полісахарид, який добувають із деяких морських водоростей зростаючих біля берегів Далекого Сходу, Китаю та Японії. Звичайний агар має вигляд пластинок, зерен або жовтувато-білого порошку. Він утворює з водою гель, який плавиться при 100⁰С і загусає при 45⁰С. Агар втрачає здатність утворювати гель у кислому середовищі. Агар містить 0,15 % азоту і 3,5 % зольних елементів. У його складі також були виявлені вітаміни – тіамін і біотин.

Бактеріальний агар „Difco” містить значно менше різних домішок і дає кращі результати, ніж звичайний агар для культури тканин. Останнім часом випробовують інші гелеутворюючі речовини, які могли б замінити агар: біогелі, поліакриламідні гелі, карагінан, перліт та інші полімери.