Материалы и методы

Анализ образцов ДНК Т. Н. Куликовского-Романова

Образцы периферической крови Т. Н. Куликовского-Романова были взяты во время хирургической операции и хранились при - 70^оС. ДНК выделялась традиционным способом фенол-хлороформной обработкой или экспресс методом с помощью реагента Chelex. Для этого 2-3 мкл крови разводилось в 200 мкл дистиллированной воды, инкубировались 15 мин, 56^оС, затем раствор кипятился при 100^оС 3 мин. 15 мкл использовали для ПЦР реакции в объеме 50 мкл. ПЦР проводилась в следующих условиях: 0.1 мкг ДНК, 0.5 ед. активности Taq-полимераза или 1 ед. активности PfUI-полимеразы, 250 мкМ dNTPa. 2 мм MgCl₂, 10 пкМ олигонуклеотидных праймеров для митохондриальной ДНК, 30 циклов, 94^оС 30 мин, 57-60^оС 30 сек., 72^оС 30 сек. Для ПЦР митохондриальной ДНК использовались следующие олигонуклеотидные праймеры:

(HV1: HI6401 (обозначенной 903) - TGATTTCACGGAGGATGGTG, L15997 (904) - CACCATTAGCACCCAAAGCT; HV2: H00З76 – TGAAATCTGGTTAGGCTGGT, L00029 - GGTCTATCACCCTATTAACCAC).

Клонирование PCR продуктов, полученных с помощью 903/904 праймеров и PfUI-полимеразы, осуществляли в вектор pBSK, рестрицированный по SmaI-сайту.

ПЦР четырех STR (HUMVWA/31; HUMTHOI, HUMFI3AI; HUMFES/FPS) проводили в одной реакции (STR Quadruplex) согласно описанным протоколам (Центр Судебной Науки, Торонто), и анализ осуществлялся с помощью автоматического генного сканера (Applied Biosystem Gene Scaner).

Анализ образцов ДНК, выделенной из костного образца № 4-46

Модифицированный метод был использован для выделения ДНК из образца № 4-46 с очисткой через Quagen колонки (набор для очистки ДНК из тканей или крови) (см. Результаты). Для ПЦР митохондриальной ДНК и секвенирования ДНК были использованы следующие олигонуклеотидные праймеры

1) HI6401 (903) – TGATTTCACGGAGGATGGTG,

2) L15997 (904) – CACCATTAGCACCCAAAGCT;

3) H00З76 – TGAAATCTGGTTAGGCTGGT,

4) L00029 - GGTCTATCACCCTATTAACCAC), а также

5) mtF16008 5' – TTTTTT GAATTC caaagctaagattctaat

6) mtR16239 5' – TTTTTT CTCGAG tggctttggagttgcagttg

7) mt R16391 5' – TTTTTT CTCGAG gaggatggtggtcaagggac

8) mt F34 5' – TTTTTT GAATTC caccctattaaccactcacg

9) mt R251 5' – tggaaagtggctgtgcagac

10) mtF174 5' – tatttatcgcacctacgttc

11) mtR465 5' – TTTTTTCTCGAG tgagattagtagtatgggag

Последовательности нуклеотидов были выбраны на основе первой опубликованной полноразмерной последовательности мтДНК человека (Anderson S. et al., 1981) и последующих разработок (Orrego C et al., 1991; Sullivan K. et al., 1991; Halland M et al., 1995) для ПЦР митохондриальной ДНК.

Аналогичные олигонуклеотидные праймеры были использованы при генетическом исследовании костных останков из захоронения вблизи Екатеринбурга, проведенного в Англии и США (Gill et al., 1994, Ivanov P. et al., 1996).

Дополнительно в данном исследовании некоторые олигонуклеотиды синтезировались с последовательностями сайтов рестрикации EcoRI и Xhol в 5'-участках для удобства клонирования PCR-продукто (см. выше олигонуклеотиды № 5-8 и № 11).

Клонирование PCR-продуктов осуществляли для обоих участков HV1 и HV2 из костного образца № 4-46 в вектор pBSK, рестрицированный по EcoRI и Xhol.

Секвенирование осуществляли двумя независимыми методами:

1) с использованием мечения продуктов секвенирования изотопом ³²P или изотопом ³³P (набор "Promega" и набор "Amersham" в случае секвенирования с термостабильной полимеразой или секвеназой);

2) с помощью флюорисцентного мечения и циклического секвенирования (ABD Perkin-Elmer набор для секвенирования и ABI автоматический "секвенатор").

Результаты

Определение структуры HV1 и HV2 участков митохондриальной ДНК Т. Н. Куликовского-Романова

Ближайшим родственником Николая II, жившим до недавнего времени в Торонто (Канада), был его племянник Тихон Николаевич Куликовский-Романов (Т.Н.К-Р). Тихон Николаевич Куликовский-Романов является сыном Великой Княгини Ольги (родной сестры Николая II) и пра-правнуком Датского Короля Кристиана IX. Таким образом, по материнской линии Николай II и Т. Н. Куликовский-Романов должны наследовать одну и ту же митохондриальную ДНК от императрицы Марии Федоровны (до крещения Датской принцессы Дагмар – жены императора Александра III).

Пробирки с образцами жидкой крови Т. Н. К-Р были сохранены О. Н. Куликовской-Романовой после его кончины в 1993 г. и переданы через Университет г. Торонто для генетических исследований (см. Приложение, Письма).

Для анализа митохондриальной ДНК было выбрано два наиболее вариабельных участка (HV1 и HV2), длиной приблизительно 400-450 нуклеотидов.

Три технических подхода было использовано для секвенирования (определения нуклеотидной последовательности или расшифровки первичной структуры ДНК) митохондриальной ДНК.

1) Амплификация HV1 и HV2 участков митохондриальной ДНК с помощью Taq-полимеразы. Затем прямое секвенирование PCR-продукта.

2) Амплификация HV1 и HV2 участков митохондриальной ДНК с помощью PfUI-полимеразы, на порядок снижающей вероятность ошибки во время реакции по сравнению с Taq-полимеразой. Затем очистка PCR-продукта через агарозный гель и секвенирование PCR -продукта.

3) Клонирование PfUI-PCR - фрагментов митохондриальной ДНК в вектор pBSK. Затем секвенирование отдельных клонов, содержащих митохондриальные ДНК-фрагменты.

Получение идентичных результатов всеми тремя методами гарантировало надежность результата. Во всех случаях секвенирование осуществлялось с помощью Applied Biosystem – машины, автоматически записывающей нуклеотидную последовательность в компьютерные данные, что исключало возможность субъективной интерпретации результатов.

В качестве примера результаты компьютерного сканирования гелей представлены на Рис.1-2. Полная последовательность нуклеотидов ДНК (HV1 и HV2 участки) Т. Н. К.-Р. представлена также на Рис. 3.

Генотипирование ДНК Т.Н.К.-Р. STR-маркерами.

Дополнительно было проведено исследование для 4-х STR маркеров, тех же самых, которые были использованы ранее для анализа предполагаемых останков Николая II (Gill et al., Nature Genetics, 1994) Для анализа ПЦР-продуктов был использован автоматический Applied Bioaystem Gene Scaner. Были получены следующие STR генотипы: HUMVWA/31: 15,18; NUMTH01: 9 3/4, 10; HUMF13A1: 3 1/2, 6; HUMFES/FPS: 10,10. По крайней мере, два аллеля с совпадающими размерами были обнаружены для HUMVMA\31 и локусов при сравнении генотипа Т-Н-К-Р с опубликованными ранее данными STR-анализа предполагаемых останков Николая II (Gill et al., Nature Genetics, 1994).

Относительно низкая частот (0.08) аллеля 15 среди европеоидов (Caucasians) (Центр Судебной Науки, Банк Данных, Торонто) позволяет предварительно предположить, что Т.Н.К-Р мог унаследовать тот же хромосомный локус индивида, чьи останки были обнаружены в групповой могиле вблизи Екатеринбурга (HUMVWA, 12 хромосома).

В этом случае генотипирование дополнительных STR маркеров, тесносцепленных с HUMVWA на хромосоме 12, а также серии STR маркеров из других хромосом в образцах Т.Н.К.-Р. и образцах № 4-46, может оказатться /так!/ полезным для подтверждения близкого родства данных индивидов.

Такой анализ было невозможно провести в течение 3-х недель (дополнительно к анализу митохондриальной ДНК) от момента постановления до даты настоящего заключения.