Практические опыты с криоконсервацией

Отряд хищных является одним из самых крупных отрядов млекопитающих. В таких семействах как куньи, кошачьи, псовые и медведи для сохранения исчезающих видов, наряду с традиционными методами, применяют репродуктивные технологии первого, второго и третьего поколений.

Криоконсервация эмбрионов полученных in vivo или in vitro с последующей их трансплантацией подготовленным самкам-реципиентам считается перспективным подходом для сохранения исчезающих видов млекопитающих. Наиболее оптимальным является трансплантация эмбрионов полученных от исчезающего вида самке-реципиенту близкородственного вида. При этом встает проблема преодоления межвидового репродуктивного барьера.

Куньи. В работе с исчезающим видом куньих - европейской норкой - была использована классическая триада эмбриотехнологии: изучение репродуктивной специфики исчезаю­щего вида, отработка технологий на близкородственных видах и, наконец, применение адаптированных технологий по отношению к собственно исчезающему виду.

Доказанной причины быстрого уменьшения численности европейской норки пока не установлено

Было исследовано несколько способов преодоления межвидового репродуктивного барьера на модели европейская норка - хорек. Наиболее эффективным оказалась трансплантация эмбрионов европейской норки межвидовым гибридам европейской норки и хорька (хонорикам и нохорикам). При этом был получен воспроизводимый результат (эксперимент повторен дважды) с эффективностью 50% (каждый второй из трансплантированных эмбрионов развивался до рождения).

Предложенная модель считается перспективной для применения как по отношению к исчезающим видам куньих, так и по отношению к другим семействам отряда хищных - прежде всего к кошачьим. Эта модель может также представлять не только практический интерес в контексте сохранения исчезающих видов, но и научную ценность для их изучения.

Создание криобанков эмбрионов и гамет, в сочетании с другими вспомогательными репродуктивными технологиями, хорошо дополняет традиционные методы консервации генетических ресурсов ex situ / in situ. Трансплантация эмбрионов от исчезающего (сохраняемого) вида самкам-реципиентам межвидовым гибридам является, исходя из полученных результатов, перспективным подходом для сохранения исчезающих видов хищных млекопитающих (Амстиславский и др., 2011).

Псовые. Использование современных репродуктивных методик имеет большой потенциал для программ сохранения исчезающих видов (Jewgenow et al. 1997, Wildt 1992). Активное изучение и успешное применение у собак таких прогрессивных техник как: криоконсервация спермы, яйцеклеток, эмбрионов и ткани гонад, трансфер эмбрионов и унтраутеринные методики искусственного оплодотворения делают их перспективным объектом для экстраполяции этих методов на диких собачьих.

По оценкам разных специалистов число пород собак в мире от 450 до 1100

Сбор семени у диких псовых возможно осуществлять методом электроэякуляции в отличие от домашних, у которых забор осуществляется методом мануальной мастурбации. Интерпретация сперморгаммы и биохимического анализа эякулята идентичны.

Изготовление охлажденной спермы, хранящейся при температуре +4°С сроком до 10 дней изготавливается с применением специальных сред (экстендеров) представляет наибольший интерес для зоопарков, позволяя обмениваться генетическим материалом без необходимости транспортировки животных.

Криоконсервация, т.е. заморозка спермы и ее хранение при температуре жидкого азота (минус 196°С) позволяет сохранять генетический материал неограниченный срок. Особенности использования экстендеров для разных видов животных должны быть дополнительно исследованы. Для домашних собак на сегодняшний день разработаны методики криоконсервации, позволяющие получать щенков более чем в 75% случаев искусственного оплодотворения замороженно-размороженной спермой.

Методика интраутеринного эндоскопического оплодотворения на сегодняшний день широко используется в ветеринарии мелких домашних животных, а так же в исследовательских программах по размножению диких кошачьих (A. Fontbonne, X. Levy, E. Fontanne 2005-2010). Суть метода заключается во введении семени непосредственно в матку при помощи эндоскопической трансцервикальной катетеризации. Использование интраутеринного осеменения приводит к значительному увеличению успешности оплодотворения при использовании консервированной спермы и в случаях невозможности естественного спаривания.

На сегодняшний день ветеринарная медицина располагает современными репродуктивными методиками, хорошо зарекомендовавших себя в работе с домашними собаками и позволяющие сохранять и транспортировать генетический материал, а так же применять технику искусственного осеменения и у диких собачьих, относящихся к охраняемым видам (Кадочникова, 2011).

Создание криобанка половых продуктов, как элемента вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), сейчас общепризнанный метод сохранения генофонда редких видов. Распространение этого метода ограничивается недостаточными знаниями особенностей физиологии репродукции, анатомии, гормональных циклов у диких видов. Существенным подспорьем является использование модельных видов, с уже относительно изученными особенностями репродукции. У представителей псовых анатомическое строение половой системы, основные стадии полового цикла, половое поведение схожи. Это позволяет использовать домашнюю собаку как модельный вид. Более того, породное разнообразие Canis familiaris, выражающееся в вариабельности размеров, конституции, характера полового поведения позволяют отрабатывать методики ВРТ, которые могут быть использованы для разных диких видов Canidae.

Были сформированы 3 группы собак с учетом их размеров, конституции тела и половой цикличности: а) мелкие собаки: шпицы, таксы, вест-хайленд-уайт терьер (п =10), средние: колли, веймаранеры, эстонские гончие (п = 8), крупные: немецкие, бордосские доги, бульмастифы (п =9). В каждой группе проводился подбор спосо­ба взятия семени (ручной на искусственную вагину, электоэякуляция, посткоитальный забор из половых путей самки). Были применены различные способы стимуляции полового возбуждения (искусственные и естественные феромоны, присутствие самки). Качество се­мени оценивалось на лазерном спермоанализаторе SFA-500 с функцией видеофиксации и компьютерным подсчётом концентрации, процента подвижных гамет и их скорости. Это позволяло не только оценить качество полученных образцов, но и провести сравнительный анализ проб от производителей разных породных групп. Поскольку имелись противоречивые данные по технологиям замораживания гамет собак, исследовались различные методы криоконсервации семени производителей, с возможностью последующего осеменения самок. На собаках данный процесс имеет преимущество, так как заложенное семя с большой вероятностью будет использовано в короткие сроки, что позволяет оценивать как качество заморозки, так и результативность осеменения таким материалом.

Особое внимание уделялось клиническому состоянию здоровья животных-доноров спер­мы. Была выявлена корреляция между общим состоянием организма и репродуктивной способностью, в частности влияние патологии глаз. Отмечено, что патологии, сформиро­вавшиеся в результате неправильной селекционной работы, и меняющие общий статус здоровья породной группы собак, отражаются на репродуктивной возможности целой породы. Наличие генетических негативных мутаций ставит под угрозу сохранность многих породных групп собак в целом. Применение новых репродуктивных технологий, в совокупности с методами ветеринарной медицины позволяют разработать алгоритмы, направленные на максимальную сохранность репродуктивной функции особей и пород в целом, а так же на сохранение генофонда редких видов.

Для многих пород собак известны генетические аномалии, влияющие на репродуктивные способности, в частности, на качество сперматозоидов. Таким образом, показатель фертильности гамет может служить также индикатором различных патологий и генетических аномалий у диких Canidae (Меньшинина, Максудов, 2011).

Медвежьи. Создание криобанка семейства Медвежьи (Ursidae) становится весьма актуальным ввиду угрозы снижения численности отдельных видов и подвидов медведей из-за освоения человеком территорий обитания, вырубки лесов, увеличения пресса охотников, изменения климата. Криобанки являются одним из элементов вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), для использования которых необходимы знания особенностей физиологии репродукции видов и отработка практических методов ВРТ для конкретных диких видов. Работы по созданию криобанка, изучению биологии репродукции и отработке технологий ВРТ для семейства Ursidae проводятся с 2009 г. С помощью электроэякуляции получена и изучена сперма у белого, бурого, очкового и гималайского медведей.

Стремительно уменьшение площади ледяных полей в Арктике в результате потепления климата ставят на грань выживания белого медведя

Из постмортальных семенников белого и очкового медведей извлечены и заморожены сперматозоиды. Изучена анатомия репродуктивного аппарата самцов этих видов. Таким образом, удалось отработать методики обездвиживания и получения спермы методом электроэякуляции, методику извлечения посмертного семени, а так же технологии криоконсервации семени разных видов семейства медвежьих. Собрана ценная информация о морфоло­гических и иных особенностях сперматозоидов медведей.

Криоконсервация только мужских гамет не позволяет в полном объеме сохранять генофонд редких видов. Соответственно, необходимо изучить возможность применения ВРТ к самкам медведей. Выбор вида и методики определяются как возможностью использования бурого медведя в качестве модельного вида для отработки ВРТ, применимых и к белому медведю, так и наличием диапаузы эмбрионов в цикле размножения этих видов медведей.

Численность единственного вида медведей южного полушария (очковый медведь) планеты катастрофически низкая

Проведён эксперимент по вакуумной аспирации эмбрионов у беременной самки бурого медведя в Нижегородском зоопарке «Лимпопо». Четырехлетняя самка, имевшая потомство в 2010 г., жившая с самцом в одной вольере в оптимальных условиях содержания, после неоднократных спариваний весной 2011 г., была обследована. С помощью УЗИ в её репродуктивные органы, были введены пластиковые канюли в матку, а затем, с помощью аспиратора, промыта полость матки средой ДМЕМ. Аспират был исследован под бинокуляром МБС-9 и микроскопом Никон, при температуре +37°С и затем вновь введён в полость матки. Опыт показал, что возможно использование ряда инструментов, используемых в ЭКО человека, для работы с самками медведей. По окончании работ самка внешних признаков нарушения здоровья не показала. Есть надежда на получение от неё приплода. Перспективная цель подобных экспериментов - отработка методик для трансплантации эмбрионов белого медведя самкам-реципиентам бурого. Таких работ с медведями пока не проводилось. Описанное в литературе получение эмбрионов бурого медведя, проводившееся хирургическим путём, менее неприемлемо для целей сохранения животных.

Планируется продолжение работ, в частности, проведение межвидовой пересадки эмбрионов от бурого к гималайскому медведю. Для этого необходимо соответствие уровней гормонов у обеих особей. Для мониторинга гормонального статуса продолжается сбор образцов фекалий от разных видов медведей для их тестирования с помощью ИФА – анализа (Малеев и др., 2011).