Лабораторна робота № 4

Тема: Будова бактеріальної клітини. Диференційні методи забарвлення.

Мета: Вивчити будову прокаріотичних організмів, оволодіти складним методом забарвлення за Грамом.

Матеріали та устаткування: культури мікроорганізмів, що вирощені на агаризованому середовищі: Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus, Streptococcus lactis, Saccharomyces cerevisiae та ін., мікроскопи МБР, МБД, стерильні піпетки, бактеріологічна петля, пінцет, препарувальна голка, тонкі предметні стекла, покривні скельця, спиртівка (брикети сухого пального), кювета з містком для фіксованих препаратів, крапельниці з фарбами, 96°-ний спирт, імерсійна олія, бензин, серветки, фільтрувальний папір, розчин, що дезінфікує, промивалка з дистильованою водою.

Барвники для забарвлення за Грамом:

1. Феноловий розчин генціану фіолетового: генціан фіолетовий – 1 г, спирт 96%-ний – 10 мл, фенол кристалічний – 2 г, вода дистильована – 100 мл.

2. Розчин Люголя: йодид калію –2 г, йод кристалічний – 1 г, вода дистильована – 300 мл. Спочатку готують концентрований розчин йодиду калію в 5 мл води, у ньому розчиняють йод, потім додають воду до 300 мл.

3. Фуксин Пфейфера: 1 мл карболового фуксину Циля і 9 мл дистильованої води.

Мікробна клітина – складна жива система, що характеризується високим ступенем упорядкованості складових її структур; кожна структура має певну життєву функцію та їхня взаємодія між собою забезпечує існування клітини, її цілісність.

Для вивчення внутрішньої будови клітин застосовують спеціальні методи забарвлення – цитохімічні методи дослідження. Багато з цих методів переслідують діагностичні цілі. За формою клітини м/о не занадто різноманітні, та в ряді випадків, щоб установити приналежність мікроба до того чи іншого роду й виду, необхідно виконати спеціальне забарвлення клітини чи речовини, що накопичується в ній.

Порядок виконання роботи

1. Вивчити ультраструктуру бактеріальної клітини.

Розглянути мікрофотографії мікроорганізмів, що одержані за допомогою електронного мікроскопа. Замалювати схематичну будову узагальненої бактеріальної клітини (додаток 1).

2. Забарвити бактерії за Грамом.

Забарвлення за Грамом є найбільш універсальним із диференціальних методів забарвлення мікробних клітин. Він заснований на розходженні в хімічному складі клітинних оболонок і має важливе діагностичне значення у визначенні видів бактерій. Усі бактерії щодо цього методу забарвлення поділяються на грампозитивні й грамнегативні.

Сутність зафарблення полягає у тому, що грампозитивні утримують комплекс генціанового фіолетового з йодом під час обробки препарату спиртом і тому забарвлюються в синьо-фіолетовий колір. У грамнегативних м/о це сполучення з'являється тимчасово і знебарвлюється після обробки спиртом. У наступному забарвлюванні фуксином вони здобувають рожево-червоний колір. Здатність клітин забарвлюватися за Грамом залежить від віку культури: у старій культурі мертві клітини завжди забарвлюються грамнегативно. Деякі бактерії (коринебактерії, протей) зафарблюються грамваріабельно. Фарбувати за Грамом необхідно клітини молодих (частіше однодобових) культур. Доцільно також офарблювати клітини контрольних мікроорганізмів, відношення яких до забарвлення за Грамом заздалегідь відоме. Мазок для зафарбовування за Грамом повинний бути тонким, щоб клітини рівномірно розподілялися на поверхні скла і не утворювали скупчень.

Техніка зафарбування за Грамом

На добре знежиреному предметному склі готують три тонких мазки різних культур мікроорганізмів: у центрі наносять мазок досліджуваного мікроорганізму (чи суміші грамнегативних і грампозитивних бактерій), по краях – контрольних культур. Клітини однієї контрольної культури повинні бути грампозитивними.

Мазки висушують у повітрі і фіксують над полум'ям пальника. Фіксація хімічними сполуками не рекомендується.

На фіксований мазок наливають розчин карболового генціанового чи кристалічного фіолетового. Мазки зафарблюють протягом 1 хвилини.

Барвник зливають і, не промиваючи препарат водою, обробляють його розчином Люголю протягом 1 хвилини до повного почорніння.

Зливають розчин Люголю і препарат, не промиваючи водою, обробляють із безперервним погойдуванням 96%-ним етиловим спиртом протягом 15-20 с. Час знебарвлення дуже істотний, за умов перебільшення зазначеного терміну знебарвлюються і грампозитивні клітини, якщо термін обробки скорочений препарат виявиться перефарбованим.

Промивши препарат водою, його додатково офарблюють протягом 1 хвилини водяним фуксином Пфейфера. Барвник зливають, препарат знову промивають водою, висушують і виконують мікроскопію з імерсійною системою. Грампозитивні бактерії за умов правильного зафарбування набувають синьо-фіолетовий колір, грамнегативні – червоно-рожевий колір фуксину.

Метод Грама в модифікації Синєва

На фіксований мазок накладають смужку фільтрувального паперу шириною 3 см, що попередньо просочений 1%-ним розчином кристалічного фіолетового та висушений (у висушеному вигляді папір може довго зберігатися). На папір наносять 2-3 краплі води і залишають його на препараті 2 хв. Надалі фарбування проводять за вищеописаною методикою. Модифікація Синєва знайшла широке застосування в практиці.

Метод Грама в модифікації Калини

На предметне скло наносять невелику краплю дистильованої води, поміщають у неї мінімальну кількість клітин мікроорганізмів і петлею додають 0,5%-ний спиртовий розчин кристалічного фіолетового. Суспензію рівномірно розподіляють на площі 1 см², підсушують і фіксують однократним проведенням над полум'ям пальника. Після цього препарат протягом 1 хвилини обробляють реактивом, що містить 10 мл 5%-ного розчину фуксину Пфейфера, 10 мл 10%-ного розчину йоду, 10 мл ацетону і 70 мл 0,5%-ного йодиду калію. Потім препарат опускають на мить у 96%-ний етиловий спирт і швидко висушують фільтрувальним папером.

Результати спостережень відобразити у вигляді малюнків. Указати назву об'єкта, відзначити морфологічні особливості організмів.

Препарати, перш ніж вимити, поміщають у дезінфікуючий розчин.