Виділення чистих культур за методом Коха

Для одержання ізольованих колоній за методом Коха і виділення з них чистих культур аеробних бактерій роблять посів на поверхню твердого живильного середовища у чашки Петрі з накопичувальної культури:

– Розплавляють стерильне агаризоване сусло в колбі на водяній бані і розливають його в 3-4 стерильні чашки Петрі.

– М/о висівають і розподіляють шпателем Дригальского чи петлею, використовуючи техніку виснаженого штриха чи мазка (рис. 8.1) послідовно в декількох чашках Петрі з застиглим твердим агаризованим середовищем:

– Спочатку на поверхню середовища першої чашки, використовуючи петлю, наносять краплю розведення накопичувальної культури й обережно розтирають її стерильним скляним шпателем по всій поверхні.

– Потім цим же шпателем із клітинами мікроорганізмів, що залишилися на ньому, засівають поверхню другої чашки. Далі цим же шпателем проводять вздовж поверхні третьої чашки Петрі.

– Після посіву чашки необхідно перевернути нагору дном і поставити в термостат із температурою, що сприятлива для даного мікроорганізму.

– Інкубують посіви звичайно протягом 2-5 днів (у залежності від швидкості росту конкретних мікроорганізмів).

– Таким чином, після інкубації у перших чашках звичайно спостерігається суцільний ріст мікроорганізмів (суцільний «газон»), а в наступних утворюються ізольовані колонії. У випадку засіву за секторами у перших відбувається суцільний ріст, а уздовж наступних штрихів виростуть відособлені колонії м/о, що є потомством однієї клітини.

– Ізольовані колонії відсівають петлею в пробірки на поверхню скошеного густого середовища чи в рідке середовище.

– Усі операції з посівів мікроорганізмів виконуються стерильно біля вогню.

 

 

Рис. 8.1 – Розсіювання мікроорганізмів на поверхню твердого середовища:

а – шпатель Дригальського; б – розсіювання; в – ріст мікроорганізмів після розсіювання шпателем; г – ріст мікроорганізмів після розсіювання петлею

 

Висівання із накопичувальної культури мікроорганізмів, що належать до факультативних аеробів чи факультативних анаеробів, для одержання ізольованих колоній роблять методом глибинного посіву в пробірки зі стовпчиком стерильного агару. Стерильною голкою беруть чисту культуру з колоній, одночасно виймають пробку, обпалюють край пробірки і, тримаючи її нагору дном, голкою над пальником роблять прокол до дна.

Виділення чистої культури анаеробних бактерій за методом Коха можливе тільки в умовах, що виключають доступ до них вільного кисню. Анаеробні мікроорганізми можна культивувати у звичайних пробірках і чашках Петрі, поміщаючи їх після посіву в анаеростати – вакуумні скляні ексикатори.

 

Порядок виконання роботи

 

1. Підготувати скошений агар (косяки) й стовпчики твердого живильного середовища у мікробіологічних пробірках для подальшого культивування та перевірки чистоти культур (МПА, сусло-агар, пептонний агар та середовище Гаузе). Заповнювати середовищем не більше, ніж на 1/3.

– Середовище з агаром нагрівають на киплячій водяній бані до повного його розплавлення. У пробірки середовище наливається шаром, не більше, ніж на 1/3 пробірки. Для цього посудину із середовищем беруть у праву руку, а стерильну пробірку, в яку наливають середовище, – у ліву. Горло колби проводять через полум'я спиртівки, ватяну пробку після розливання обпалюють. Під час роботи пробку тримають між мізинцем і безіменним пальцем правої руки, після розливу обпалюють.

– Для одержання стовпчика з живильним середовищем пробірку залишають для затвердіння середовища у вертикальному положенні, а для одержання скошеної поверхні пробірки із середовищем установлюють у нахиленому положенні на спеціальну підставку, але так, щоб верхній кінець косяка закінчувався за 3-4 см до пробки. Стовпчики використовують для посіву культури уколом.

– Потрібно стежити за тим, щоб край пробірок чи флаконів не був змочений живильним середовищем, тому що ватно-марлеві пробки можуть приклеїтись до скла під час стерилізації і важко вийматимуться, ускладнюючи тим процес роботи.

2. Підготувати 3 чашки Петрі з твердими пластинками живильного середовища: розлити МПА, пептонний агар, СА, вівсяний агар, середовище Гаузе у чашки Петрі (15–20 мл).

– Стерильне густе живильне середовище розплавляють у колбі на водяній бані й охолоджують до 50-60°С.

– Виймають чашки Петрі з паперу, в якому вони стерилізувалися, і ставлять їх на рівну горизонтальну поверхню.

– Беруть пробірку чи колбу з охолодженим до 50-60°С живильним середовищем, виймають ватяну пробку, обпалюють у полум'ї пальника край посудини і тримають його в нахиленому положенні.

– Відкривають кришку чашки Петрі лівою рукою убік полум'я, а правою рукою наливають середовище в кількості 15-20 мл, злегка рухаючи чашкою для рівномірного розподілу середовища за всією поверхнею дна чашки Петрі.

– Залишають чашку Петрі на столі до повного затвердіння середовища, потім ставлять у термостат на 15-20 хвилин для підсушування.

3. Підготовити до стерилізації 5-6 пробірок з водогінною водою для розведення суспензій м/о.

4. Виконати посів накопичувальних культур молочнокислих м/о (із кефіру), а також оцтовокислих бактерій (Acetobacter aceti) поверхневим способом за методом виснаженого штриха в чашки Петрі із сусло-агаром, аеробних бактерій (Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus) на МПА або пептонний агар. Перед посівом виконати мікроскопічний аналіз мікроорганізмів накопичувальних культур. Слідкувати, щоб петля не пошкодила поверхні середовища.

Поверхневий спосіб посіву на щільні середовища в чашки Петрі:

– На тверде середовище наносять петлею краплю посівного матеріалу і потім рівномірно розподіляють його на поверхні, користуючись стерильним шпателем Дригальського. За умови взяття рідини петлею вона повинна затягти петлю тонкою плівкою. Піпеткою користаються в тому випадку, коли матеріал засівають у великій кількості чи в певному об’ємі.

– Шпатель виймають із паперу і беруть у праву руку.

– Відкривають кришку чашки Петрі лівою рукою і вносять у неї шпатель.

– Розмазують краплю посівного матеріалу шпателем обертальними рухами на поверхні агарової пластинки (надавлювати шпателем на тверде середовище не треба, тому що можна йому зашкодити).

– З метою економії середовищ і посуду можна користатися однією чашкою, розділивши її на сектори і послідовно засівати їх штрихом (метод виснаженого штриха). Для цього матеріал беруть петлею і проводять нею ряд паралельних штрихів спочатку на поверхні першого сектора, а потім послідовно засівають всі інші сектори клітинами, що залишилися на петлі. З кожним наступним штрихом відбувається зменшення кількості клітин, що засіваються.

– Переносять шпатель у посудину з дезінфікуючим розчином.

5. Для виділення культур і вивчення культуральних властивостей анаеробних культур зробити посів бактеріальних культур накопичувальних культур (Clostridium pasteurianum, Clostridium butiricum) у чашки Петрі із МПА і молочнокислих бактерій (із кефіру) глибинним способом.

Техніка глибинного посіву на тверді середовища в чашки Петрі:

– Відкривають стерильну чашку і поміщають петлею чи піпеткою краплю посівного матеріалу на дно чашки.

– Розплавляють агаризоване живильне середовище у пробірці чи колбі й охолоджують його до 45-50°С.

– Обпалюють край пробірки чи колби в полум'ї пальника і виливають середовище (15-20 мл) у чашку Петрі з внесеним посівним матеріалом, дотримуючись правил стерильної роботи.

– Розподіляють рівномірно посівний матеріал у живильному середовищі, для чого обережно круговими рухами переміщають чашку Петрі на поверхні стола.

– Залишають чашку Петрі на столі до повного затвердіння середовища.

– Роблять на чашці напис (число, назва м/о).

– Усі посіви для вирощування м/о поміщають у термостат із температурою, що сприятлива для їхнього росту.

6. Виконати пересівання культур бактерій (Clostridium butiricum), вирощених на рідких живильних середовищах в інше рідке стерильне живильне середовище (картопляне середовище).

Техніка пересівання культур мікроорганізмів, вирощених у рідкому середовищі:

– Клітини мікроорганізмів, що виросли в рідкому живильному середовищі, відбирають частіше стерильною піпеткою.

– Зі стерильного паперу виймають градуйовану стерильну піпетку за верхній кінець, беруть піпетку середнім і великим пальцями правої руки, не торкаючись поверхні тієї частини піпетки, що буде вводитися в посудину з рідким середовищем.

– Беруть у ліву руку пробірку (чи колбу) із культурою м/о, що вирощена в рідкому середовищі, і тримають її у вертикальному положенні, щоб не замочити пробку.

– Відкривають пробку, дотримуючись правил асептики, і вводять піпетку в пробірку.

– Набирають у піпетку суспензію м/о, закривають пробкою пробірку (чи колбу), вносять певну кількість суспензії у свіже стерильне живильне середовище, дотримуючись правил стерильності.

– Після використання піпетку поміщають у посудину з дезінфікуючим розчином, не торкаючись нею навколишніх предметів (0,5%-ний водяний розчин хлораміну чи 3-5%-ний водяний розчин фенолу).

7. Зробити пересівання чистих культур бактерій (Micrococcus lisodeikticus) на скошений МПА і мікроскопічних грибів (Streptomyces recifensis, Blakeslea trispora) на скошений СА з пробірки в пробірку за допомогою бактеріологічної петлі.

Техніка посіву мікроорганізмів, що вирощені на твердому середовищі в пробірках, в іншу пробірку із середовищем:

– Запалюють пальник. Посіви виконують над полум'ям пальника, щоб гаряче повітря перешкоджало осадженню м/о з навколишнього повітря.

– Беруть у праву руку бактеріологічну петлю, за допомогою якої здійснюють посів (петлю тримають як олівець). Стерилізують бактеріологічну петлю в полум'ї пальника, прожарюючи дріт до червоності, та одночасно обпалюють частину утримувача, що примикає до петлі і буде вводитися в пробірку з культурою м/о. Упродовж прожарювання петлю тримають у полум'ї майже вертикально, щоб весь дріт був розпечений.

– Беруть у ліву руку дві пробірки – одну зі стерильним середовищем (далі від себе), іншу – із культурою м/о.

– Не випускаючи бактеріологічної петлі, мізинцем і безіменним пальцем правої руки притискають зовнішні кінці ватяних пробок до долоні і виймають пробки з пробірок. Класти пробки на стіл не можна.

– Злегка обпалюють у полум'ї пальника край відкритих пробірок.

– Прожарену бактеріологічну петлю вводять у пробірку з культурою м/о. Щоб не зашкодити клітинам, петлю спочатку прохолоджують, доторкаючись до внутрішньої поверхні пробірки чи до живильного середовища, вільного від клітин мікроорганізмів, і тільки після цього відбирають невелику кількість мікробної маси.

– Виймають петлю і вводять її у пробірку зі стерильним живильним середовищем, уникаючи дотику зі стінками пробірки.

– Проводять петлею від дна догори зигзагоподібний чи прямий штрих, злегка торкаючись поверхні агару.

– Обпалюють ватяні пробки і край пробірок одночасно в полум'ї і закривають обидві пробірки.

– Закриту ватяною пробкою пробірку з культурою ставлять у штатив, а витягнутий матеріал використовують для готування препарату чи для пересівання культури у свіже середовище.

– Обпалюють петлю в полум'ї.

– Усі описані маніпуляції варто виконувати біля полум'я, за можливістю швидко, щоб не забруднити культуру сторонніми мікроорганізмами.

Результати роботи протоколюють. Результати всіх посівів розглянути на наступному занятті.

Петлі, голки обпалюють у полум’ї пальника. Посуд дезінфікують. Результати роботи протоколюють.

Результати всіх посівів розглядають на наступному занятті.

 

 

Лабораторна робота № 8

 

Тема: Дослідження культуральних властивостей мікроорганізмів. Перевірка чистоти культур.

Мета: Визначити характер росту мікроорганізмів на твердому живильному середовищі. Описати отримані колонії м/о, що засіяні на попередньому занятті. Виконати мікроскопічне дослідження мазків різних колоній, забарвлених за Грамом. Пересіяти мікроорганізми вивчених колоній на косий агар для виділення чистих культур.

Матеріали та устаткування: колонії мікроорганізмівна твердих середовищах у чашках Петрі, мікробіологічні пробірки зі стерильним скошеним сусло-агаровим середовищем, МПА, вівсяним агаром, спиртівка (брикети сухого пального), мікробіологічна петля, мікроскоп МБР, предметні і покривні стекла, барвники для забарвлення за Грамом – генціанвіолет, фуксин, розчин Люголю, 96%-ний спирт, пробірки, поплавці, (трубочки діаметром 5-7 мм, довжиною 35-45 мм, запаяні з одного кінця), ваги, пептон, К₂НРО₄, агар, індикатор бромкризолпурпур чи бромтимолблау (1,6%-ний спиртовий розчин), вуглеводи (глюкоза, лактоза, маніт, сахароза та ін.).

До культуральних, чи макроморфологічних, властивостей належать характерні риси росту мікроорганізмів на твердому й рідкому живильному середовищах. На поверхні твердих живильних середовищ мікроорганізми можуть рости у вигляді характерних колоній, чи штрихів суцільного газону. Колонією називають ізольоване скупчення клітин одного виду, що виросло в більшості випадків з однієї клітини. У залежності від того, де росте мікроорганізм (на поверхні густого живильного середовища, в товщі її чи на дні посудини), розрізняють поверхневі, глибинні і донні колонії. Колонії, що виросли на поверхні середовища, відрізняються великою різноманітністю і є найбільш істотною особливістю росту багатьох мікроорганізмів на твердому субстраті. В описі колоній враховують наступні ознаки: форму, профіль, край, структуру, розмір, поверхню, колір колонії. Культуральні властивості є діагностичними для ідентифікації м/о.

Чистота культури мікроорганізмів повинна бути ретельно перевірена. Це здійснюється, як правило, декількома способами – візуальним (дослідження колоній), мікроскопічним контролем і висівом на ряд живильних середовищ.

Звичайно колонії з клітин чистої культури, що висіяна на густе середовище, схожі одна на іншу, що є доказом чистоти культури (але є виключення, наприклад, у випадку дисоціації колоній на гладкі (S-) і складчасті (R-форми)).

Інший критерій чистоти культури – це морфологія клітин. Для чистої культури характерний високий ступінь морфологічної подібності клітин у забарвлених препаратах. Однак бувають виключення у залежності від віку культури, використовуваного середовища та інших умов росту.

 

Порядок виконання роботи

 

1. Переглянути колонії на чашках Петрі. Колонії, що виросли на твердому живильному середовищі, проглянути спочатку неозброєним оком чи через лупу. Потім помістити чашки на столик мікроскопа нагору дном і вивчити колонії у прохідному світлі з об'єктивом 8х. Відзначити, описати й замалювати переважні форми (3-5 видів), вибираючи ізольовані колонії. Опис колоній виконують за схемою, що наведена нижче. Ознаки колоній заносять у таблицю.

В описі колоній враховують наступні ознаки:

Форму колонії (рис. 8.1) – округла, амебоподібна, ризоїдна, неправильна і т. д.

Структура колонії (рис. 8.2) – однорідна, дрібно- чи грубозерниста, струминна і т. д.

Розмір (діаметр) колонії вимірюють у мм; якщо розміри колонії не перевищують 1 мм, то їх називають точковими.

Оптичні властивості (блиск і прозорість) колонії – блискуча, матова, тьмяна, борошниста, прозора, напівпрозора, непрозора, флуоресціююча.

Колір колонії – безбарвна (грязно-білі колонії належать до безбарвних) чи пігментована – біла, жовта, золотава, жовтогаряча, бузкова, червона, чорна і т. д. В описі колоній актиноміцетів відзначають пігментацію повітряного і субстратного міцелію. Особливо відзначають виділення пігменту в субстрат.

Поверхня колонії – гладка, шорсткувата, борозниста (горбиста), складчаста, зморшкувата, із концентричними колами чи радіально покреслена.

Профіль колонії (рис. 8.3) – плоский, опуклий, кратероподібний, конусоподібний.

Край колонії (рис. 8.4) – рівний, хвилястий, зубцюватий, торочкуватий і т. д.

Рис. 8.1 – Форма колоній: 1 – кругла; 2 – кругла з фестончастим краєм; 3 – кругла з валиком; 4 і 5 – ризоїдні; 6 – із ризоїдним краєм: 7 – амебоподібна; 8 – нитковидна; 9 – складчаста; 10 – неправильна; 11 – концентрична; 12 – складна

 

Рис. 8.2 – Структура колоній:

1 – однорідна; 2 – дрібнозерниста; 3 – грубозерниста; 4 – струминна; 5 – волокниста

 

 

Рис. 8.3 – Профіль колонії:

1 – вигнутий; 2 – кратероподібний; 3 – горбистий; 4 – колонія, що вростає у субстрат; 5 – плоский; 6 – опуклий; 7 – краплеподібний; 8 – конусоподібний

 

 

Рис. 8.4 – Край колонії:

1 – гладкий; 2 – хвилястий; 3 – зубцюватий; 4 – лопатевий; 5 – неправильний; 6 – війчастий; 7 – нитчастий; 8 – ворсинчастий; 9 – гіллястий

 

Консистенцію колонії визначають, доторкаючись до її поверхні петлею. Колонія може легко зніматися з агару, бути густою, м'якою чи такою, що вросла в агар, слизуватою (прилипати до петлі), тягучою, плівчастою (знімається цілком), крихкою (легко ламається за умов дотику петлею).

Край і структуру колонії визначають із невеликим збільшенням мікроскопа. Для цього чашку поміщають на столик мікроскопа кришкою вниз. Консистенцію визначають під час відсівання колоній, доторкаючись до поверхні петлею.

Розміри й деякі інші особливості колоній змінюються з віком і залежать від складу середовища, тому в їхньому описі указують вік культури, склад середовища й температуру культивування.

Здатність до емульгування – рівномірна чи зерниста суспензія у воді, слабко чи зовсім не суспендується у воді.

2. Після опису колонії піддаються мікроскопічному дослідженню. З кожної групи колоній, що виросли на густих середовищах, для вивчення морфології і тинкторіальних властивостей мікроорганізмів приготувати препарати «роздавлена крапля», виконати мазки й забарвити за Грамом. Препарати переглянути з об'єктивами 40х і 90х, відзначити форму й сполучення клітин, наявність чи відсутність спор, визначити, до яких морфологічних груп мікроорганізмів вони належать. Мікроскопічну картину замалювати.

 

Таблиця –Ознаки колоній мікроорганізмів

№ колонії

Форма

Діаметр, мм

Блиск, прозорість

Колір

Поверхня

Профіль

Край

Структура

Консистенція

Флуоресценція

Здатність до емульгування

Морфологія мікроорганізмів

 

Оформити протокол роботи.

3. Підготувати живильні середовища та посуд для роботи № 10.

4. Пересіяти одержані чисті культури на скошене тверде живильне середовище в мікробіологічні пробірки.

Лабораторна робота № 9

Тема: Методи кількісного обліку мікроорганізмів.

Мета: Визначити чисельність мікроорганізмів за методом Коха. Користуючись методом прямого рахунку мікробних клітин у рахункових камерах, визначити їхню чисельність.

Матеріали й устаткування: предметні й покривні стекла, барвники, водяна баня зі штативом, бактеріологічна петля, пінцет, спиртівка, 0,1% розчин агар-агару, окулярний мікрометр, об'єктивний мікрометр, мікроскоп, освітлювач, чисті і накопичувальні добові культури мікроорганізмів (дріжджі), рахункова камера Горяєва, стерильні пробірки, стерильні піпетки на 10 мл та 1-2 мл, колба зі стерильною водою, спирт 96⁰, зразки ґрунту, стерильні живильні середовища (МПА, СА, вівсяний агар, середовище Гаузе, картопляний агар та ін.), електроплитка, стерильні чашки Петрі, мікробіологічні пробірки зі стерильною водопровідною водою, шпателі Дригальського, піпетки, скляні палички.