Порядок проведення роботи

1. Приготувати середовище для виявлення амілолітичної активності (г/л): пептон – 10,0; КН₂РО₄ – 5,0; розчинний крохмаль – 2,0; агар – 15,0; рН середовища 6,8–7,0. Середовище стерилізують при 1 атм. та розливають у стерильні чашки Петрі.

2. Приготувати стовпчики з МПЖ для дослідження протеолітичної активності. МПЖ готують, додаючи 10-15 г желатини до 100 мл МПБ, залишають на 30 хвилин для набрякання, нагрівають на водяній бані до повного розчинення желатини, розливають у пробірки по 10 мл, стерилізують тиском 0,5 атм. 15 хв.

3. Приготувати молочний агар для дослідження протеолізу казеїну. Знежирене молоко стерилізується при 0,5 атм. та в підігрітому вигляді додається до стерильного та остудженого до 50°С 3%-ного водяного агару. Одержане середовище розливають у чашки Петрі.

4. Зробити посіви досліджуваних мікроорганізмів на підготовлені поживні середовища. В чашки Петрі – штрихом по діаметру чашки, в стовпчики МПЖ – методом уколу. Культивують посіви до 10 діб.

5. Дослідити ріст мікроорганізмів на поживних середовищах.

Середовище з крохмалем обробити розчином Люголю та визначити зону амілолітичної активності.

На стовпчиках з МПЖ виявити розрідження середовища. За характером розрідження встановлюється активність протеаз (швидкість і вид розрідження). Процес розрідження йде зверху, причому різні м/о дають характерну для них форму розрідження: у формі цвяха, лійки, лантухоподібне, пухирчасте та ін.

На молочному агарі визначити гідроліз казеїну по зоні просвітлення середовища біля колоній. Особливо чітко зона видна після обробки середовища розчином 5%-ної трихлороцтової кислоти.

6. Визначити каталазну активність мікроорганізмів.

Каталазна активність властива більшості аеробних м/о. Для виявлення ферменту каталази на предметне скло бактеріальною петлею нанести мікробну масу і відразу ж додати краплю 3%-ного розчину перекису водню. Виділення пухирців кисню вкаже на наявність у мікробів каталази.

 

Каталаза

H₂O₂ –––––––––® Н₂О + О₂­.

 

7. Визначити оксидазну активність мікроорганізмів.

Декілька крапель суміші (1:1) 1%-ного спиртового розчину a-нафтолу і водяного розчину диметил-п-фенілендиаміну наносять на колонії у чашках з агаром. Позитивна реакція: забарвлення колоній у фіолетово-синій колір протягом 30 с.

8. Оформити роботу у вигляді звіту.

Після закінчення роботи продезінфікувати посуд, м/б приналежності.

 

 

Лабораторна робота № 11

 

Тема: Антибіотики й антагонізм.

Мета: Вивчити антибіотичні властивості мікроорганізмів, спектр антагоністичної дії.

Матеріали та устаткування: досліджувані культури мікроорганізмів, чашки Петрі з МПА, стерильні диски антибіотиків, бактеріологічна петля, пінцет, стерильні ватяні тампони, стерильна водопровідна вода.

На мікроорганізми діють не тільки абіотичні фактори навколишнього середовища, але й інші мікроорганізми, що живуть в одному і тому ж середовищі. Взаємини між ними можуть бути різними: метабіоз, паразитизм, симбіоз, антагонізм. У випадку антагоністичних відносин м/о виділяють у навколишнє середовище продукти обміну речовин, що можуть або гнітити ріст інших м/о, або убивати їх.

Антибіотики – це специфічні продукти життєдіяльності мікроорганізмів, що мають високу фізіологічну активність стосовно певних груп мікроорганізмів, затримуючи або цілком придушуючи їхній ріст.

Антибіотичні речовини – різноманітні за складом і механізмом дії; кожен антибіотик виявляє біологічний вплив лише стосовно певних організмів чи груп організмів, не впливаючи на інші.

Утворення антибіотиків – це спадково закріплена особливість метаболізму організмів, специфічна особливість виду м/о, що виникла в результаті еволюційного розвитку як одна з пристосувальних особливостей, що обумовлює прояв широко розповсюджених у світі мікроорганізмів антагоністичних відносин.

До синтезу антибіотиків, головним чином, здатні гриби з роду Penicillium, актиноміцети і деякі групи бактерій. Процес утворення антибіотиків тісно пов'язаний з розвитком організмів – продуцентів і здійснюється, як правило, у фазу уповільненого росту.

Для визначення спектра антимікробної дії антибіотика чи чутливості м/о до антибіотиків використовуються методи, пов'язані зі здатністю антибіотика дифундувати в товщу субстрату.

 

Порядок виконання роботи

1. Визначити антибіотичну активність мікроорганізмів (наприклад, актиноміцетів) методом перпендикулярних штрихів чи методом агарових блоків.

У першому випадку продуцент і тест-організми вирощують на одному середовищі, у другому – на різних, тому що не завжди те саме середовище однаково сприятливе як для розвитку продуцента й утворення їм антибіотика, так і для росту тест-культур.

На живильний агар у чашці Петрі висівають штрихом передбачуваний продуцент антибіотичної речовини. Посів штрихом роблять вздовж діаметра чашки. Під час посіву чашки тримають агаровою пластиною вниз (щоб спори не розлетілися). Після того, як продуцент виросте (через 5-7 днів) і утворить антибіотичну речовину, що дифундує в товщу агару, перпендикулярно до його штриха підсівають штрихами тест-організми (Staphylococcus aureus, Escherichia.coli, Bacillus subtilis, Bacillus cereus чи ін.), починаючи від периферії чашки. Для посіву використовують густі суспензії у стерильній водопровідній воді. Чашки інкубують при 28-30°С упродовж 2-8 діб у залежності від швидкості росту тест-організмів.

Вплив антибіотика на мікроорганізми, що тестуються, визначають за величиною відстані між краєм штриха продуцента антибіотика (наприклад, актиноміцету) і початком росту тест-організму. Нечутливі до антибіотичної речовини тест-організми ростуть поблизу штриха продуцента. Якщо антибіотик впливає на тест-організм, то ріст останнього буде спостерігатися удалині від штриха продуцента. Чим більше ця відстань, тим більше чутливий тест-організм до антибіотичної речовини, що утворюється даним продуцентом (рис. 2.14 – 1).

Рис. 11.1 – Виявлення антибіотичних властивостей м/о за методом перпендикулярних штрихів (1); визначення чутливості м/о до антибіотиків за методом паперових дисків (2)

 

2. Визначити чутливість мікроорганізмів до антибіотиків методом паперових дисків.

На чашки Петрі з підсушеним середовищем МПА засівають досліджувану культуру суцільним газоном. Посів роблять шпателем Дригальського чи стерильним ватяним тампоном, змоченим суспензією досліджуваної культури. Стерильним пінцетом на агар щільно накладають індикаторні паперові диски (4-5 штук), просочені розчином певного антибіотика на рівній відстані один від одного на відстані близько 2,5 см від центра чашки (рис. 2 14 – 2).

Диски нумерують на зворотній стороні дна чашки. Засіяні чашки з нанесеними дисками термостатують (нагору дном) при 37°С упродовж 16-18 годин.

Антибіотики, що дифундують у товщу агару, запобігають чи затримують ріст чутливих до них культур мікроорганізмів. Це виявляється в утворенні навколо відповідних дисків зон гноблення росту, що чітко виділяється на фоні суцільного газону росту культури, яка тестується.

Результати чутливості м/о до антибіотиків відобразити у вигляді таблиці. Величина зони гноблення визначає ступінь чутливості мікроорганізмів до даного антибіотика.

 

Чутливість мікроорганізмів до антибіотиків

 

Діаметр зони затримки росту, мм	Ступінь чутливості до антибіотика
Більше 25	Високочутливі
15 – 25	Чутливі
10 – 14	Малочутливі
Менше 10 і повна відсутність	Стійкі

 

Результати роботи оформити у вигляді звіту.