Методика выполнения лабораторной работы

Тема 2

Работа с микроорганизмами

 

2.1. Культивирование микроорганизмов

2.1.1. Терминология

 

Выращивание микроорганизмов на питательных средах назы­вают культивированием (от лат. cultus– выращивание), а развившиеся в результате микроорганизмы – культурой. При развитии в жидкой среде культуры образуют суспензию, осадок или пленку, при развитии на плотной среде – колонии. Культура может быть чистой – содержать потомство клетки только одного вида и накопительной – состоять преимущест­венно из клеток одного вида микроорганизмов.

Внесение клеток микроорганизмов или какого-либо ис­следуемого материала (образца почвы, пробы воды) в стериль­ную питательную среду для получения чистой или накопи­тельной культуры называют посевом. Перенесение уже выра­щенных клеток из одной среды в другую (стерильную) называют пересевом, или пассированием (от лат. passus– чере­дование).

Обычно микроорганизмы выращивают при определен­ной постоянной температуре в термостатах (деревянных или металлических шкафах) или термостатных комнатах. В тех и других постоянная температура поддерживается с помощью терморегуляторов.

Культивирование при определенной температуре называ­ется инкубацией, или инкубированием (от лат. incubatio – выра­щивание, высиживание птенцов).

Выращивают микроорганизмы в стеклянной посуде: про­бирках, колбах или чашках Петри. Для этого стеклянную посу­ду, не бывшую в употреблении, очищают от щелочи кипячени­ем в растворе, содержащем К₂Сг₂О₇ (6%) и концентрирован­ную H₂S0₄ (6%).

В пробирках микроорганизмы культивируют как в жидких, так и на плотных средах. Жидкой средой для аэробных культур заполняют обычно 1/з пробирки, для анаэробных – ²/з.Если плотная среда в пробирках предназначена для последую­щего выращивания микроорганизмов, при подготовке к стери­лизации ее наливают на ¹/з–1/4 объема пробирок.

После стерилизации пробирки с еще не застывшей сре­дой раскладывают на ровной поверхности стола в наклонном (под небольшим углом) положении для получения скошенной поверхности агара. Это так называемые косяки – косые или скошенные среды.

Плотная среда, застывшая при вертикальном положении пробирки, называется столбиком. Столбики питательной сре­ды, занимающей ¹/₃–V2 объема пробирки, используют для по­сева культуры уколом. Столбики питательной среды, занимаю­щие ²/з объема пробирки, после стерилизации применяют для заливки стерильных чашек Петри, предназначенных для мик­робиологических посевов.

Пробирки со средами и культурами во время работы устанавливают в штативы; пробирки со средами, подготовленны­ми к стерилизации, помещают в проволочные корзины или металлические ведра с отверстиями; пробирки с культурами при инкубации или хранении – в картонные коробки.

При культивировании микроорганизмов в колбах ис­пользуют только жидкие питательные среды. Для аэробных микроорганизмов среду наливают тонким слоем (например, 30 мл в колбы Эрленмейера на 100 мл), для анаэробных мик­роорганизмов колбу заполняют на ²/з объема.

В чашках Петри микроорганизмы культивируют лишь на плотных средах. Высота этой посуды – около 1,5 см, диаметр – 8–10 см, причем диаметр верхней чашки (она слу­жит крышкой) несколько больше диаметра нижней.

Для работы с микроорганизмами используют специаль­ные бактериологические иглы, петли и шпатели. Их изготовляют из платиновой проволоки, которую закрепляют в специальных металлических держателях или впаивают в стеклянные палочки. Толщина игл и петель не должна пре­вышать 0,5 мм, толщина шпателя может быть 1,5 мм и более.

При посевах и пересевах культур микроорганизмов из колоний, выросших на плотных средах, применяют иглы или шпатели. Последние используют и для взятия клеток микроор­ганизмов из колоний, врастающих в субстрат. Суспензии мик­роорганизмов берут петлей.

При приготовлении препаратов микроорганизмов предмет­ные стекла удерживают на весу пинцетами Корнэ или специаль­ными пинцетами-держателями. Сушить препараты целесообразно на верхнем яру­се сушильного металлического столика Коха. Промывать их удобно на приспособлениях-перекладинах или на так называемых препаратодержателях – параллельно расположенных стеклянных палочках, соединенных резиновыми труб­ками (длина палочек 20–30 см, трубок 15–20 см). Палочки устанавливают над фарфоровыми чашками или ваннами.

2. 1. 2. Техника посева

 

Посев (или пересев) всегда проводят вблизи горелки. При по­севе клеток микроорганизмов из пробирки в пробир­ку обе пробирки (одну – с культурой, другую – со стериль­ной питательной средой) берут в левую руку. Одну пробирку зажимают между указательным и средним пальцами (первая пробирка). Нижний конец ее свободно лежит на большом паль­це (с его левой стороны). Вторую пробирку зажимают между средним и безымянным пальцами. Она должна лежать парал­лельно первой. Ее нижний конец располагается с правой сто­роны большого пальца. Большой палец, находясь между про­бирками, должен быть в естественном, ненапряженном состоя­нии и слегка удерживать пробирки в параллельном по от­ношению друг к другу положении.

При взятии мазка пробирки должны находиться в на­клонном положении, гарантирующем стерильность культуры. При вертикальном расположении пробирок возможно попада­ние из воздуха посторонних клеток микроорганизмов.

В пламени горелки тщательно обжигают бактериологиче­скую иглу (петлю), держа ее в правой руке в отвесном положе­нии. Мизинцем правой руки вынимают из второй пробирки ватную пробку и зажимают ее между мизинцем и ладонью. Пробку первой пробирки зажимают между безымянным и средним пальцами правой руки. Снова слегка обжигают иглу и вводят ее в пробирку с культурой. Платиновая игла остывает очень быстро. Легким прикосновением ее к колонии микроор­ганизмов берут небольшое количество микробной массы и пе­реносят во вторую пробирку.

При высеве в плотную скошенную среду иглой с культу­рой легким движением, не повреждая среды, проводят пря­мую или волнообразную черту по ее поверхности – посев штрихом.

При посеве в столбик питательной среды иглу вводят в толщу ее центральной части – посев уколом. При посеве в жидкую среду (или из жидкой среды) лишь слегка накло­няют пробирки, чтобы избежать смачивания пробок и краев пробирок.

Пробки, перед тем как ими закрыть пробирки, обжига­ют в пламени. Удобнее сначала закрыть первую пробирку, а затем – вторую.

 

 

2.2. Методы приготовления препаратов микроорганизмов

2.2. 1. Техника взятия культуры для приготовления препарата

 

Пробирку с культурой держат в левой руке почти в горизон­тальном положении вблизи горелки. Перед взятием культуры правой рукой вынимают ватную пробку из пробирки, зажимая ее между мизинцем и ладонью, а края пробирки обжигают на пламени горелки. Иглу держат в правой руке большим, указа­тельным и средним пальцами. Обожженной в пламени бакте­риологической иглой из пробирки берут небольшое количество микробной массы.

Если культуру берут из жидкой среды, не следует сильно наклонять пробирку, чтобы не смочить ее края и пробку. Для взятия культуры лучше пользоваться петлей. После взятия культуры края пробирки и пробку обжигают в пламени и за­крывают пробирку.

 

2.2.2. Исследование живых клеток микроорганизмов методами раздавленной и висячей капли

 

В обоих случаях окрашивание объекта проводят «прижизнен­ными» красителями – витальная окраска. Прижизненными красителями могут служить метиленовый синий, нейтральный красный в концентрациях от 0,001 до 0,0001%.

Оба метода применяют для выявления подвижности кле­ток микроорганизмов, наблюдения за размножением, образо­ванием и прорастанием спор, установления реакции микроор­ганизмов на химические соединения и физические факторы воздействия, изучения размеров клеток, характера их располо­жения, определения запасных веществ в клетке.

Препараты микроскопируют, слегка затемняя поле зре­ния; конденсор немного опускают, поступление света регули­руют вогнутым зеркалом. Вначале пользуются малым увеличением – объектив 8х, после того как обнаруживают край капли, устанавливают объектив 40х или иммерсионный (90х). Более четкие результаты можно получить при микроско­пии в темном поле или в фазовом контрасте.

В случае использования метода раздавленной капли на чистое предметное стекло наносят каплю водопроводной воды. В нее вносят культуру и смешивают с водой. Накрывают кап­лю покровным стеклом так, чтобы под ним не образовывались пузырьки воздуха. Стеклянной палочкой прижимают покров­ное стекло к предметному и удаляют избыток воды фильтро­вальной бумагой, поднося ее к краям покровного стекла. При просмотре приготовленного препарата под микроскопом с им­мерсионным объективом на покровное стекло наносят каплю кедрового масла.

Метод удобен для исследования подвижности бактери­альных клеток, а также просмотра крупных объектов – микро­скопических грибов, дрожжей. Его применяют также при изу­чении запасных веществ клетки.

Для длительных наблюдений за клетками микроорганиз­мов применяют метод висячей капли. Для него требуется спе­циальное предметное стекло с лункой посередине. На стериль­ное покровное стекло наносят иглой негустую суспензию мик­роорганизмов, выращенных в жидкой питательной среде или подготовленных для данной цели.

 

2.2.3. Фиксированные препараты микроорганизмов

 

В микробиологии часто готовят фиксированные препараты. Их рассматривают под микроско­пом в окрашенном виде. Под фиксацией подразумевается та­кая обработка живого объекта, которая дает возможность бы­стро прервать течение жизненных процессов в объекте, сохра­нив его тонкую структуру. В результате фиксации клетки прочно прикрепляются к стеклу и лучше прокрашиваются. Фиксация необходима в случае работы с патогенными микро­организмами (в целях безопасности).

Приготовление мазка. На чистое обезжиренное предмет­ное стекло наносят каплю водопроводной воды. Для обезжи­ривания стекол используют смесь этилового спирта и серного эфира в соотношении 1:1. Эти операции проводят вдали от горелок. Прокаленной бактериологической иглой из пробир­ки с культурой берут небольшое количество микробной массы и вносят в каплю воды. Каплю тщательно размазывают пет­лей по стеклу на площади около 4 см².

В случае, если суспензия густая, ее сначала разводят во­дой. Для этого прокаленной петлей берут немного суспензии и переносят в каплю воды на другое предметное стекло. Сус­пензию нормальной густоты размазывают тонким слоем по стеклу, затем мазок сушат на воздухе при комнатной темпера­туре или при слабом нагревании, держа препарат высоко над пламенем горелки. Сильное нагревание препарата при сушке не рекомендуется для избежания коагуляции белков, искажаю­щей структуру и форму клеток. Высушенный препарат фикси­руют.

Фиксация мазка. Ее проводят над пламенем горелки при исследовании формы клеток или при помощи химических со­единений для изучения внутренней структуры клеток. В пер­вом случае препарат три-четыре раза медленно проводят нижней стороной над пламенем горелки. Во втором случае используют хромовые соединения, формалин, осмиевую кис­лоту, ацетон.

Один из распространенных приемов фиксации – обра­ботка препарата 96%-ным спиртом или смесью равных объ­емов этилового спирта и эфира (жидкость Никифорова). Для этого препараты погружают на 10–30 мин в фиксирующую жидкость.

Окрашивание препарата. При окрашивании мазка пре­парат помещают на препаратодержатель. На мазок наносят несколько капель красителя. В зависимости от вида красителя и цели исследования продолжительность окрашивания варьи­рует от 1 до 5 мин, в отдельных случаях занимая до 30 мин и более. По окончании окрашивания препарат промывают во­дой, фильтровальной бумагой удаляют воду, подсушивают на воздухе и микроскопируют.

Существуют простые и дифференцированные методы окраски.

При простой окраске используют какой-либо один кра­ситель, например метиленовый синий, фуксин, генциан фи­олетовый в щелочных или карболовых растворах. При этом прокрашивается вся клетка.

При дифференцированной окраске отдельные структуры клетки окрашиваются разными красителями. Таковы методы окраски по Граму, окраски спор.

Кроме окраски по Граму к сложным дифференциальным методам окраски относятся:

1. Окраска кислотоустойчивых бактерий по Цилю–Нильсену фиксированный на пламени горелки мазок окрашивают 3–5 мин раствором карболового фуксина Циля или окрашенной фуксином бумажкой с подогреванием до появления паров, но не доводя краску до кипения;

– дают препарату остыть, бумажку снимают, сливают избыток краски, препарат промывают водой;

– окрашенный препарат обесцвечивают 5%-ным растворомH₂SO₄ (серной кислотой) в течение 3–5 с или 96%-ным этиловым спиртом, содержащим 3% по объему соляной кислоты, несколько раз погружая в стаканчик с раствором;

– после обесцвечивания остаток кислоты сливают, препарат промывают водой;

– докрашивают дополнительно метиленовой синью Леффлера 3–5 мин, промывают водой, подсушивают и микроскопируют.

Результаты окраски: при окраске препаратов по методу Циля–Нильсена кислотоустойчивые бактерии окрашиваются фуксином в красный цвет.

2. Окраска по Романовскому–Гимзе

Краска Романовского–Гимзы состоит из смеси азура, эозина и метиленовой сини. Перед употреблением к 10 мл дистиллированной воды прибавляют 10 капель краски Романовского–Гимзы. Приготовленный раствор краски наносят на фиксированный мазок и оставляют на 1 ч. Затем краску сливают, препарат промывают водой и высушивают на воздухе. Краска Романовского–Гимзе окрашивает микробы в фиолетово-красный цвет.

Для окрашивания микроорганизмов применяют кислые и основные красители. Первые вступают в реакцию с вещест­вами основной природы, вторые – кислотной природы. По­скольку в белках есть и основные (NH₂) и кислотные (-СООН) радикалы, клеточные структуры хорошо окрашиваются и теми и другими красителями.

Из основных красителей наиболее часто в микробиологии применяют: зеленые – янус зеленый, мети­леновый зеленый, малахитовый зеленый; синие – виктория, метиленовый синий; фиолетовые – генциан фиолетовый, кристаллический фиолето­вый, метиленовый фиолетовый; красные – нейтральный красный, сафранин, фук­син, гематоксилин; коричневые – везувин, хризоидин; черные – индулин.

Кислые красители могут быть следующие: черные – нигрозин; красные и розовые – кислый фуксин, эритрозин; желтые – конго, пикриновая кислота, флуоресцин.

Основные красители интенсивнее окрашивают объект в более щелочной среде, кислые – в более кислой. Чтобы раз­личить растворы кислых или основных красителей, в них по­гружают полоски фильтровальной бумаги. Они несут отрица­тельный электрический заряд. В случае основного окрашиваю­щего раствора его катионы, обуславливающие окрашивающую способность, фиксируются отрицательным зарядом бумаги, и по ней вследствие капиллярности будет распространяться только вода (в виде бесцветной полосы). Если раствор содер­жит кислый краситель, его анионы будут подниматься по бу­маге и окрасят ее.

Окрашивание живых клеток микроорганизмов (виталь­ная окраска) – очень трудоемкий процесс и поэтому исполь­зуется в микробиологии редко. Микробные клетки фиксируют не только в целях безопасности (если культуры патогенны) или закрепления их на стекле, но и для того, чтобы они могли бо­лее интенсивно поглотить краситель. Предполагают, что при фиксировании увеличивается число свободных амино- и кар­боксильных групп, в результате повышается сродство клетки к красителю.

Красители можно разделить на позитивные и негативные.

Позитивные красители окрашивают непосредственно клетки микроорганизмов и другие объекты. Из красителей, применяемых в микробиологии, большинство относится к по­зитивным. Они окрашивают клетки при комнатной температу­ре в течение 30–60 с.

Негативные красители окрашивают пространство, окру­жающее клетки микроорганизмов. В результате клетки выгля­дят силуэтами на окрашенном фоне.

Некоторые микроорганизмы (например, спирохеты) и отдельные структуры (внеклеточная слизь), плохо выявляе­мые с помощью позитивных красителей, хорошо прокрашива­ются негативными красителями. Споры без соответствующей обработки не прокрашиваются, и поэтому при окрашивании клеток бацилл позитивными красителями они имеют вид пре­ломляющих свет включений в вегетативных клетках.

 

Методика выполнения лабораторной работы

Цель работы: изучить технику посева, методы приготовления препаратов микроорганизмов, фиксацию препаратов; методы окрашивания препаратов и классификацию красителей. Приобрести навыки по приготовлению фиксированных препаратов бактерий и освоить технику окраски препаратов бактерий простыми методами.

Материалы, реактивы, оборудование: микроскоп; пробирки; колбы; чашки Петри; бакте­риологические иглы; петли; шпатели; штативы; предметные и по­кровные стекла; генцианвиолет; раствор Люголя; зубочистки; спиртовка; 96%-ный этиловый спирт; фильтровальная бумага; фуксин; промывалка.