2018-01-08
1058
Тема: Методи культивування мікроорганізмів. Поживні середовища.
Мета роботи: Ознайомитись з методами культивування мікроорганізмів, технікою посіву мікроорганізмів на різні середовища. Засвоїти техніку виділення чистих культур.
Матеріали, реактиви, обладнання: чисті культури бактерій Васіllius subtilis, Е. соlі та Staphilоcoccus аиrеиs, пробірки з МПБ і МПА (агарові стовпчики, скошений агар), мікробіологічна петля.
Основні відомості
Для культивування мікроорганізмів у лабораторних умовах використовують поживні середовища. Поживні середовища повинні містити всі сполуки необхідні мікроорганізмам для їх зростання. У зв’язку з тим, що конструктивні і енергетичні процеси у мікроорганізмів досить різнопланові, універсальних середовищ, однаково придатних для зростання всіх без виключення мікроорганізмів не існує.
Вибір поживного середовища для культивування залежить від властивостей мікробів (типу живлення, дихання) і мети культивування. У мікробіологічній практиці використовують велику кількість поживних середовищ. Їх класифікують за походженням сировини, консистенцією, складом і призначенням.
За походженням сировини поживні середовища бувають натуральні, штучні, синтетичні.
Натуральні поживні середовища виготовляють зазвичай із сировини тваринного походження: м’яса (МПБ, МПА), молоко, яєць, риби, жовчі, сироватки крові, або рослинного походження: соєвих бобів, гороху, рису, ячменю, моркви, картоплі, буряку.
Штучні середовища готують за відповідними рецептами із різних настоїв, відварів тваринного та рослинного походження з додаванням неорганічних солей, вуглеводів.
Синтетичні середовища готують із хімічно чистих сполук в точно вказаних концентраціях: середовище Виноградського - для нітріфікуючих бактерій, глюкозо-мінеральне середовище для родів Pseudomonas, Achromobacter тощо.
За консистенцією середовища бувають рідкі (МПБ), напіврідкі, щільні (МПА), сипучі (розварене пшоно), сухі. Напіврідкі і щільні середовища виготовляють із рідких, додаючи до них агар-агар або желатину. Агар-агар – це тверда волокниста речовина, яку виробляють з морських червоних водоростей. Желатин – продукт денатурації колагену – білка сполучної тканини.
За складом поживнісередовища поділяють на прості і складні.
До простих відносять: м'ясопептонний бульйон (МПБ), м'ясопептонний агар (МПА), поживний желатин, пептонну воду, сусло рідке, сусло-агар.
Складні поживні середовища готують і простих, додаючи до них кров, сироватку крові тварин, вуглеводи, жовток курячого яйця, молоко тощо.
За призначенням розрізняють поживні середовища основні, спеціальні, елективні, диференціально-діагностичні, середовища накопичення.
Основні (загального вжитку) середовища використовують для культивування більшості мікроорганізмів. Це прості поживні середовища: м'ясопептонний агар (МПА), поживний желатин, пептонна вода.
Спеціальні середовища використовують для культивування певних видів мікроорганізмів які погано ростуть на інших середовищах або взагалі не ростуть. Наприклад, жовтково-сольовий агар (ЖСА) використовується для стафілокока.
Елективні середовища, які забезпечують переважний розвиток мікроорганізмів одного виду, чи групи мікроорганізмів: МПБ із глюкозою для культивування стрептококів, середовище Чапека - для грибів. Їх застосовують для виділення і накопичення мікроорганізмів.
Диференціально-діагностичні середовища, які дозволяють швидко розділити одні мікроорганізми від інших. Це середовища, які містять різні цукри з індикатором, середовище Ендо для ідентифікації Е. соlі, середовище Симмонса для виявлення ентеробактерій тощо.
Середовища накопичення – це рідкі селективні середовища (МПБ).
Деякі прокаріоти виявляють потребу в одній певній органічній сполуці із групи амінокислот, вітамінів чи азотистих основ, які самі не здатні синтезувати. Такі органічні речовини потрібні у дуже малих кількостях і називаються факторами росту, а організми які їх потребують – ауксотрофами, на відміну від прототрофів, які синтезують усі необхідні їм органічні сполуки.
Фактори росту можуть бути 2-х типів: неорганічні й органічні. До неорганічних факторів росту належать мікроелементи: Co, Zn, Mo, Mg, Fe, Cu та інші. Мікроелементи входять до активної групи багатьох ферментів. В якості органічних факторів слугують вітаміни, пурини, пиримідини та амінокислоти.
Більшість мікроорганізмів, що використовуються в мікробіологічних процесах, належать до прототрофів. Окремі мікроорганізми є ауксотрофами за кількома факторами росту. Зокрема, деякі молочнокислі бактерії потребують для росту всіх амінокислот, пуринів, піримідинів і вітамінів групи В. У деяких мікроорганізмів (молочнокислі бактерії, окремі штами E. coli, дріжджі) потреба у вітамінах є постійною і специфічною ознакою.
Методи культивування аеробів:
1. на поверхні щільних і рідких поживних середовищ;
2. глибинне культивування в рідких середовищах – на гойдалках (струшування або обертання);
3. продування, аерація стерильним повітрям.
Методи культивування анаеробів:
1. вирощування у високому шарі середовища;
2. у товщі щільного середовища (трубка Бурі) для чистих культур;
3. по Хангейту;
4. вирощування в анаеростатах;
5. вирощування під шаром мінеральної олії.
Хід роботи
Завдання 1. Техніка посіву чистих культур на поживні середовища.
При посіві, чи приготуванні препарату, клітини мікроорганізмів беруть бактеріологічною петлею, якщо культура виросла на твердому поживному середовище і використовують стерильні піпетки при вирощуванні мікроорганізмів у рідинному середовищі. Відбір клітин з твердого середовища виконують так: пробірку з культурою беруть в ліву руку так, щоб поверхня живильного середовища з нальотом вирощених мікробів була обернена вгору, і тримають її у нахиленому стані. У праву руку беруть петлю, прокалюючи її у полум'ї пальника. Потім, не випускаючи петлі, мізинцем і безіменним пальцями правої руки прижимають зовнішній кінець ватної пробки до долоні і виймають пробку із пробірки. Край відкритої пробірки опалюють у полум'ї пальника.
Вводячи в пробірку петлю охолоджують, торкаючись її кінцем до стінки пробірки, аби гаряча петля не викликала загибелі клітин. Відібравши невелику кількість мікробної маси, опалюють внутрішній кінець ватної пробки і закривають нею пробірку. Вилучений матеріал вводять у пробірку з чистим поживним середовищем, не торкаючись стінок пробірки. Посів на тверде поживне середовище проводять легким розтиранням матеріалу на поверхні середовища, не пошкоджуючи його. При посіві на скошену поверхню агару петлю із посівним матеріалом вносять у конденсат і штрихуючими рухами розтирають матеріал, водячи петлею знизу вгору. Штрих ведуть від стінки до стінки.
Необхідно пам'ятати, що при посіві з пробірки в пробірку, зручно обидві пробірки помістити на перевернуту долоню лівої руки, утримуючи їх великим пальцем. При цьому повинно бути добре видно поверхню засівного середовища й поверхню середовища з мікроорганізмами. Пробірки утримують паралельно одна одній у нахиленому положенні пробками в бік полум'я пальника. Трьома пальцями правої руки беруть бактеріальною петлю, тримаючи її як олівець, і стерилізують її у полум'ї до червоного накалювання. Петлю слід утримувати в полум'ї майже вертикально.
Якщо посів проводять у рідинне середовище, то пробірки тримають майже вертикально, щоб не замочити пробки. Петлю із культурою мікроорганізмів занурюють безпосередньо в середовище. Якщо посів ведуть у товщу агаризованого середовища голкою з посівним матеріалом, то стовпчик проколюють по центру. Після посіву петлю виймають із пробірки, опалюють горличко пробірки і пробку. Залишки культури на кінці петлі або голки спалюють у полум'ї. Усі описані вище маніпуляції проводять біля полум'я пальника якомога швидко, щоб не забруднювати культуру іншими мікроорганізмами. Студенти повинні самостійно провести пересів чистих культур бактерій на скошений агар. Необхідно слідкувати за тим, щоб при засіві петля не дряпала щільне середовище.
Результати пересіву передивляються на наступному занятті. Замалювати характер росту бактерій у різних середовищах.
Завдання 2. Виділення чистих культур мікроорганізмів методом розсівання в чашки Петрі.
Кожен студент одержує заздалегідь приготовлену суміш суспензії з двох видів бактерій. Із суміші готується мазок, забарвлюється за Грамом і роздивляється під мікроскопом. У правильно приготовленому препараті в кожній суміші знаходять бактерій двох видів, наприклад, стафілокок (Гр+) і кишкова паличка (Гр -). Потім суміш бактерій за допомогою петлі наносять на поверхню МПА, розлитого заздалегідь у чашки Петрі. Олівцем по склу розділяють дно чашки Петрі на чотири сегменти. Інокуляцію проводять послідовно по сегментах, повертаючи чашку за годинниковою стрілкою, паралельними штрихами (відстань між штрихами 0,5 мм). На петлю необхідно брати небагато матеріалу. Чашки підписують і ставлять для культивування до термостату.
Контрольні запитання:
1. Які існують поживні середовища?
2. Що таке фактори росту?
3. Методи культивування аеробів.
4. Методи культивування анаеробів.
5. Техніка пересіву мікроорганізмів на щільні поживні середовища.
6. Техніка пересіву мікроорганізмів у рідинні поживні середовища?
7. Методи виділення чистих культур бактерій.
