Третичная и четвертичная структура белка

Под третичной структурой белка подразумевают пространственную ориентацию полипептидной спирали или способ укладки полипептидной цепи

в определенном объеме. В стабилизации третичной структуры принимают участие: ковалентные связи (между двумя остатками цистеина — дисульфидные мостики и карбокс.группа);ионные связи между противоположно заряженными боковыми группами аминокислотных остатков;водородные связи;гидрофильно-гидрофобные взаимодействия. При взаимодействии с окружающими молекулами воды белковая молекула «стремится» свернуться так, чтобы неполярные боковые группы аминокислот оказались изолированы от водного раствора; на поверхности молекулы оказываются полярные гидрофильные боковые группы.Первым белком, третичная структура которого была выяснена Дж. Кендрью, оказался миоглобин кашалота. Это сравнительно небольшой белок с мол. м. 16700,содержащий 153 аминокислотных остатк, представленный одной полипептидной цепью..По современным представлениям, третичная структура белка после завершения его синтеза в рибосомах формируется совершенно автоматически, самопроизвольно и полностью предопределяется первичной структурой.Нарушение третич.структуры приводит:к изменению св-в белка и потеря активности. Четвертичная структура взаимное расположение нескольких полипептидных цепей в составе единого белкового комплекса. Белковые молекулы, входящие в состав белка с четвертичной структурой, образуются на рибосомах по отдельности и лишь после окончания синтеза образуют общую надмолекулярную структуру. В состав белка с четвертичной структурой могут входить как идентичные, так и различающиеся полипептидные цепочки.Эпимолекула-белок с четвертичной структурой.

7.Физико- хим.св-ва белков.Размеры и формы белков.Амфотерные св-ва белков.Изоэлектрическая точка.Растворимость и денатурация. Хим.св-ва: 1.Гидратация.
Процесс гидратации означает связывание белками воды, при этом они проявляют гидрофильные свойства: набухают, их масса и объем увеличивается. 2.Горение.Белки горят с образованием азота, углекислого газа и воды, а также некоторых других веществ. Горение сопровождается характерным запахом жженых перьев.3. Цветные реакции.
Биуретовая – происходит взаимодействие слабощелочных растворов белков с раствором сульфата меди(II) с образованием комплексных соединений между ионами Cu2+ и полипептидами. Реакция сопровождается появлением фиолетово–синей окраски.4.Амфотерные свойства.В белках содержатся карбоксил и аминогруппа и при действии щелочей белок реагирует в форме аниона – соединяться с катионом щелочи, образуя соль альбуминат.При действии же кислот он становится катионом, образуя синтонин.5. Гидролиз белков.Реакция гидролиза идет с образованием аминокислот.
Физ.св-ва:кристал.в-ва,белого цвета,имеющие большую мол.массу. Форма:белковые частицы бывают шарообразные,удлиненные, нитевидные,построены асимметрично. Размеры: Молекулярная масса белков колеблется от 6000 (нижний предел) до 1000000 и выше в зависимости от количества отдельных полипептидных цепей в составе единой молекулярной структуры белка. Изоэлектрическая точка (pI) — кислотность среды (pH), при которой определённая молекула или поверхность не несёт электрического заряда. В изоэлектрической точке суммарный заряд белков, обладающих амфотерными свойствами, равен нулю и белки не перемещаются в электрическом поле. В изоэлектрической точке белки наименее устойчивы в растворе и легко выпадают в осадок. Изоэлектрическая точка белка в сильной степени зависит от присутствия в растворе ионов солей; в то же время на ее

величину не влияет концентрация белка. Потеря белком (или другим биополимером) нативной структуры называется денатурацией. Денатурация может быть полной или частичной, обратимой или необратимой. Самый известный случай необратимой денатурации белка в быту — это приготовление куриного яйца, когда под воздействием высокой температуры растворимый в воде прозрачный белок овальбумин становится плотным, нерастворимым и непрозрачным. Денатурация в некоторых случаях обратима, как в случае осаждения водорастворимых белков с помощью солей аммония, и используется как способ их очистки. Растворимост ь белков в растворителях неодинакова и зависит от многих факторов: природы, состава и рН растворителя, ионной силы и температуры раствора, структурных особенностей молекулы данного белка и других факторов. В результате чего одни белки хорошо растворимы в воде, другие - в водных растворах нейтральных солей, третьи - в слабых растворах кислот или щелочей, четвертые - в смеси воды и органических растворителей (например, этанола или ацетона).

8.Методы выделения и очистки белка.Электрофорез,хроматография,фракционирование солями и органическими растворителями. Последовательность операций по выделению белков состоит в следующем: измельчение биологического материала (гомогенизация); извлечение белков, точнее, перевод белков в растворенное состояние (экстракция); выделение исследуемого белка из смеси других белков, т.е. очистка и получение индивидуального белка. Гомогенизация биологического материала. Перед выделением белков из биологических объектов (органы и ткани

животных, микроорганизмы, растения) исследуемый материал тщательно измельчают до гомогенного состояния, т.е. подвергают дезинтеграции вплоть до разрушения клеточной структуры. Эту процедуру, называемую гомогенизацией, проводят при помощи ножевых гомогенизаторов

Длявыделения ряда белков из плотных животных и растительных объектов часто используют валковые или шаровые мельницы.Успешно применяется также метод попеременного замораживания и оттаивания ткани, в основе действия которого лежит разрушение клеточной оболочки,вызванное кристаллами льда. При экстракции белков широко применяют различные буферные смеси с определенными значениями рН среды, органические растворители, а также неионные детергенты –

вещества, разрушающие гидрофобные взаимодействия между белками и липидами и между белковыми молекулами. Фракционирование и очистка белков. После достижения полной экстракции белков, т.е. перевода белков в растворенное состояние, приступают к разделению – фракционированию смесибелков на индивидуальные белки. Для этого применяют разнообразные

методы: высаливание, тепловую денатурацию, осаждение органическими растворителями, хроматографию, электрофорез, распределение в двухфазных системах, кристаллизацию. Хроматография- разделение белковых смесей заключающийся в пропускании подлежащей функционирования белковой смеси через колонку, заполненную адсорбентом.

В результате происходит разделение анализируемых веществ и их концентрирование в строго определенном слое адсорбента. Затем через колонку пропускают подходящие элюенты, которые ослабляют силы адсорбции и выносят с током раствора индивидуальные вещества. Последние

последовательно собирают в коллекторе фракций.При выделении и очистке белков используют четыре основных типа хроматографии: адсорбционную (В качестве адсорбентов используют активированный древесный уголь, гель фосфата кальция, оксиды алюминия или кремния.), распределительную (осуществляется на колонках, в которых в качестве стационарной фазы

применяют влажный крахмал или силикагель), ионообменную (Ионообменные смолы являются поли-

мерными органическими соединениями, содержащими функциональные группы, способные вовлекаться в ионный обмен) и аффинную (Основана на принципе избирательного взаимодействия белков (или других макромолекул) с закрепленными (иммобилизованными)на носителе специфическими веществами – лигандами, которыми могут быть субстраты или коферменты (когда выделяют какой-либо фермент),антигены (или антитела), гормоны или рецепторы и т. д.

Электрофорез- основан на способности белков перемещаться под действием электрического поля с неодинаковой скоростью а растворе,на влажной фильтровальной бумаге и т.д. В последнее время более широкое распространениеполучили методы зонального электрофореза белков на различных

носителях, в частности на твердых поддерживающих средах: гелях крахмала и полиакриламида, целлюлозе. Преимущества состоят в том, что исключается размывание

границы белок-растворитель в результате диффузии и конвекции, нетребуется налаживания сложной аппаратуры для определения положения границы, а для анализа необходимо небольшое количество белка.Одним из наиболее распространенных методов фракционирования белков является диск-электрофорез в полиакриламидном геле, при котором используют пары буферных растворов с различными значениями рН и разной степени пористости гель.

Метод изоэлектрического фокусирования – изотахофореза, основанные на проведении электрофореза в поддерживающих средах с градиентом рН. Точное местоположение на колонке каждого белка из смеси определяется значением его изоэлектрической точки, т.е. состоянием, при котором суммарный электрический заряд белковой частицы при данном значении рН равен нулю. При использовании метода изоэлектрического фокусирования применяют смеси синтетических

полиаминополикарбоновых кислот (амфолины) для создания градиента рН в диапазоне от 3,0 до 10,0.

Методо фракцирования белков солевыми растворами основан на том, что каждый индивидуальный белок,выделяемый из смеси осаждается из нее при определенной концентрации той или иной соли, при том как другие белки при данной концентрации соли остаются в растворе.Процесс осаждения белка из раствора под действием соли называется высаливание. Из органических растворителей для фракционирования белков применяются метиловый и этиловый спирты(применяется при выработке заменителей крови).

Очистка белков( для полного освобождения от примесей): методы очистки- диализ -длительное пропускание воды через сосуд,в кот.погружен диализационный мешочек. При диализе применяют полупроницаемые мембраны(целлофан,коллодийнаяпленка), диаметр пор которых варьирует в широких пределах. Белки, как правило, не диффундируют через такую мембрану, в то время как низкомолекулярные вещества легко проникают через нее в окружающую среду.

Метод кристаллизации белков основан на достижении критической точки начала осаждения белка из раствора сульфата аммония при медленном повышении температуры.

Ультрафильтрация основана на продавливании растворов белка через специальные мембраны, задерживающие белковые молекулы, что позволяет не только освободить белковые растворы от низкомолекулярных примесей, но и концентрировать их. Гельфильтрация -зерна сефадекса долго удерживают низкомолекулярные вещества(гель сефадекса).