Вирусы характеризуются малыми размерами тела, отсутствием самостоятельных белоксинтезирующих и энергию генерирующих систем, выраженным цитотропизмом и облигатным внутриклеточным паразитизмом. Культивирование вирусов проводят в культурах клеток, органных культурах, развивающихся куриных эмбрионах, восприимчивых лабораторных животных. Широкое распространение получил предложенный в 1952 г Р. Дюльбекко метод бляшек (негативных колоний), позволяющий производить количественное определение вирусов. Для выделения вирусов монослой клеток после удаления питательной среды заражают вирусосодержащим материалом и покрывают слоем агара, содержащего индикатор нейтральный красный. Чашки (флаконы) инкубируют при 370С. Через 48 – 96 ч выявляются пятна – бляшки. Они имеют диаметр 1 – 3 м и выглядят неокрашенными на розовом фоне. Пятна возникают за счет цитопатического действия (ЦПД) вируса. ЦПД вирусов может проявляться в виде следующих изменений:
1. Равномерная мелкозернистая деструкция клеток (полиовирусы, вирусы Коксаки).
|
|
2. Очаговая мелкозернистая дегенерация клеток (вирус гриппа, клещевого энцефалита).
3. Гроздевидная дегенерация клеток (аденовирусы).
4. Крупнозернистая равномерная деструкция клеток (вирус герпеса).
5. Симпластообразование (респираторно – синцитиальные вирус, вирус кори).
О росте вирусов в клетках можно судить и с помощью индикатора, добавляемого к питательной среде. Если клетки активно осуществляют метаболизм, рН среды сдвигается в кислую сторону, и среда окрашивается в жёлтый цвет. В случае размножения вируса клетки погибают, рН среды мало меняется, и она сохраняет первоначальный (малиновый) цвет или (при нейтральной рН) приобретает оранжевый. Некоторые вирусы, в частности, вирус гриппа, обладают особыми рецепторами (гемагглютининами), с помощью которых они адсорбируются на эритроцитах и вызывают их склеивание (гемагглютининацию). Такие вирусы легко обнаруживаются с помощью реакции гемагглютининации или гемадсорбции (эритроциты адсорбируются на инфицированных вирусами клетках культуры тканей).
Для культивирования и изучения вирусов используют органные культуры – небольшие фрагменты органов животных, культивируемые на поверхности плотной или жидкой питательной среды. В микробиологической практике для выделения, культивирования и идентификации вирусов используют куриные эмбрионы. Вирусы могут быть выделены их исследуемого материала путём заражения восприимчивых лабораторных животных (например, морских свинок, белых мышей, крыс белых, хомяков сирийских и т. п.).
ЗАДАНИЕ
1. Учесть результаты посева воздуха седиментационным методом (Коха).
|
|
2. Учесть результаты посева пробы почвы для определения перфрингенс – титра.
3. Произвести заражение куриных эмбрионов.
Техника заражения куриных эмбрионов
Отобрать свежие, оплодотворенные, с хорошо просвечивающей и не имеющей трещин скорлупой КЭ. Инкубацию проводить в гнёздах штатива тупым концом яйца вверх в хорошо вентилируемых инкубаторах или термостатах при 37 – 37,50С, относительной влажности 63 – 65 %. Для заражения отобрать 4 – 13 – дневные эмбрионы с выраженными кровеносными сосудами, желточным мешком и подвижной тенью. Перед заражением скорлупу яиц обработать спиртом, обжечь над пламенем и в области введения смазать 2 % йодной настойкой. Средств ввести в аллантоисную и амниотическую полости. Проколоть ножницами небольшое отверстие в скорлупе над воздушной полостью и ввести с помощью иглы шприца исследуемый материал в количестве 0,1 – 0,2 мл на глубину 1 – 2 см. Отверстие залить парафином. При заражении в полость амниона иглу шприца или пастеровскую пипетку направить к зародышу под контролем овоскопа и ввести исследуемый материал (закрытый способ заражения). При выполнении открытого способа заражения в скорлупе над воздушной полостью вырезать отверстие размерами 0,5 – 0,7 х 0,5 см, удалить скорлупную оболочку, вскрыть хорионаллантоисную оболочку, захватить пинцетом амниотические оболочки и ввести в полость исследуемый материал. Отверстие в скорлупе закрыть покровным стеклом, смоченным в расплавленном парафине. Зараженные КЭ поместить в термостат.
4. В готовых препаратах изучить характер внутриклеточных включений, образуемых вирусами.
Контрольные вопросы
1. Каковы особенности химического состава и структурной организации вирионов?
2. Какие признаки лежат в основе систематики вирусов?
3. Каковы особенности вирусных нуклеиновых кислот и белков?
4. Каковы формы взаимодействия вируса с клеткой хозяина?
5. Какими методами производится культивирование вирусов?
6. Что собой представляют перевариваемые тканевые культуры?
7. Что такое цитопатическое действие вируса и как оно может проявляться?
8. Какими методами производится заражение куриного эмбриона?
9. Что собой представляют внутриклеточные включения, образуемые вирусами?