ТЕМА 2. методы работы с бактериофагами

Бактериофаги являются вирусами, паразитирующими в бактериальной клетке. На основании формы и строения различают пять морфологических типов бактериофагов: с длинным отростком, футляр которого сокращается; с длинным несокращающимся отростком; с коротким отростком; с аналогом отростка и нитевидные фаги. Первые три морфологические типа содержат двунитчатую ДНК, четвёртый – однонитчатую ДНК или РНК, пятый тип – однонитчатую РНК. Головка бактериофага образована белковыми капсомерами и имеет, как правило, полигональную форму. В её полости располагаются плотно скрученная ДНК или РНК, а также несколько аминов. Отросток, соединяющийся с головкой, шейкой, предназначен для прикрепления к рецепторам бактериальной клетки и её инфицирования. Бактериофаги в зависимости от типа вызываемой у бактерии инфекции делят на вирулентные и умеренные. Вирулентные дают литическую продуктивную инфекцию, в результате чего образуется новая генерация фагов. Умеренные вызывают, как правило, абортивную лизогенную инфекцию, которая состоит в интеграции геномов бактерии и лизогенного фага.

Бактериофаги широко распространены в природе и встречаются всюду, где имеются бактерии. Поэтому их можно выделить из различных объектов внешней среды (водоёмы, сточные воды), из организма человека и животных. Бактериофаги находят широкое применение в различных научных исследованиях. В практической работе они используются в целях идентификации ряда возбудителей (фагочувствительность), диагностика (фагодиагностика), для выявления связей между источниками инфекции (фаготипирование), для лечения (фаготерапия) и предупреждения (фагопрофилактика) некоторых заболеваний.

ЗАДАНИЕ

1. Выявить результаты заражения куриных эмбрионов. Обработать скорлупу над воздушной полостью спиртом, йодом, снова спиртом и обжечь над пламенем. Ножницами удалить часть скорлупы над воздушной полостью. Снять пинцетом подскорлупную оболочку и пастеровской пипеткой или шприцем отсосать аллантоисную жидкость в стерильную пробирку.

2. Поставить реакцию гемагглютинации для выявления вируса.

Активная реакция гемагглютинации

Для качественного обнаружения вируса к капле вируссодержащей суспензии на предметном стекле добавить каплю 1 % суспензии отмытых куриных эритроцитов. В положительной реакции вирусы адсорбируются на эритроцитах, что через несколько минут проявится образованием агглютинатов. В контроле каплю суспензии эритроцитов смешать с каплей физраствора.

3. Произвести титрование бактериофага двухслойным методом Грациа. Приготовить 10 – кратные разведения бактериофага, для чего в пробирку с 4,5 мл стерильного физиологического раствора внести 0,5 мл суспензии фага (разведение 10 ^{– 1}), новой пипеткой 0,5 смеси перенести во 2 – ю пробирку с 4,5 мл физиологического раствора (разведение 10 ^{– 2}), затем в 3 – ю пробирку (разведение 10 ^{– 3}) и т. д. Расплавить 0,7 % – ый питательный агар, разлить в пробирки по 2,5 мл, охладить до 45 – 50⁰С, внести в пробирки 0,2 – 0,3 л бульонной культуры чувствительных бактерий и 1 мл фага из соответствующего разведения, перемешать, быстро вылить в чашку с агаром и распределить равномерно по её поверхности путём покачивания. После застывания агара чашки инкубировать в термостате при температуре 37⁰С.

4. Провести типирование бактерий с помощью бактериофагов. На агаровую поверхность в чашке Петри вылить 1 мл бактериальной суспензии, покачиванием чашки равномерно распределить бактерии, остаток культуры удалить пипеткой. На сектора чашки нанести петлей типовые фаги. После подсыхания капель чашки поместить в термостат.

5. Поставить опыт Ньюкомба. На 4 чашки с питательным агаром было засеяно по 0,1 мл бактериальной суспензии. Чашки инкубировались 4 часа до появления первых признаков видимого роста. На 2 чашках произвести перераспределение бактерий путём растирания стеклянным шпателем поверхности среды, после чего на все чашки налить по 1 мл вирулентного бактериофага и покачиванием чашки распределить его равномерно по всей поверхности чашки. Посевы поставить в термостат при температуре 37⁰С.

Контрольные вопросы

1. Каковы основные особенности бактериофагов?

2. Какие существуют морфологические типы бактериофагов?

3. Какими особенностями характеризуются фаговые нуклеиновые кислоты и белки?

4. Каковы особенности взаимодействия бактериофагов с клеткой хозяина?

5. В чём различия между вирулентными и умеренными фагами? Что такое лизогения?

6. Из каких объектов производится выделение бактериофагов?

7. Какое практическое применение находят бактериофаги?

8. Что собой представляет титр фага и как он определяется?

9. Каков принцип метода фаготипирования? С какой целью его производят?

10. В чём сущность опыта Ньюкомба?

11. Как выявляют результаты заражения куриных эмбрионов?